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目的:本研究目的旨在探讨低剂量羧化黑碳(Carboxylated black carbon)和醋酸铅(Lead acetate,Pb)对人体支气管上皮细胞(BEAS-2B)的联合毒性作用。将支气管上皮细胞单独或联合暴露于低剂量羧化BC(6.25μg/mL)和Pb(4μg/mL)中,通过观察细胞的活力、产生的氧化应激、DNA损伤、线粒体膜电位的改变、细胞凋亡和细胞炎症等联合毒性指标,研究其联合毒性。析因分析也可以用于确定羧化BC和Pb之间的潜在相互作用。方法:采用CCK-8试剂盒检测羧化黑碳和重金属铅共暴露24小时对BEAS细胞存活率的影响;采用过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛试剂盒检测细胞膜的完整性和细胞氧化应激;采用DCFH-DA探针检测羧化黑碳和铅联合染毒后细胞的ROS水平;采用单细胞凝胶电泳技术检测细胞DNA受损伤程度;采用JC-1探针检测细胞内线粒体膜电位发生的变化,通过线粒体膜电位(MMP)检测试剂盒检测;通过流式细胞仪检测黑碳和铅材料诱发的细胞凋亡效应。结果:羧化BC(6.25μg/mL)诱导的细胞活力与对照组相比无明显变化。同样,4μg/mL剂量下,铅诱导的细胞毒性没有显著变化,因此,我们选择羧化BC(6.25μg/mL)和铅(4μg/mL)来研究它们的共暴露效应和相互作用。与对照组相比,单独暴露于羧化BC或联合暴露于羧化BC和Pb的BEAS-2B细胞的LDH水平显著升高,并且暴露于羧化BC和Pb的细胞的LDH水平最高。析因分析表明,LDH含量的增加是由羧化BC和Pb的协同作用引起的。与单一处理组相比,羧化BC和Pb共暴露可显著增加MDA含量,降低GSH-Px和SOD活性。这表明,与单一处理组相比,联合处理组能在更大程度上增强氧化损伤。同样,在结合或羧化BC中有更多的荧光阳性细胞。因此,羧化BC和Pb的共暴露比单独羧化BC或Pb处理组能产生更多的细胞内ROS。细胞DNA损伤结果显示与对照组相比,单独暴露于羧化BC或Pb的BEAS-2B细胞对DNA损伤无明显影响。而BEAS-2B细胞暴露于羧化BC和Pb的联合作用下,可引起DNA损伤,表现为尾长、尾DNA含量、橄榄尾距和DNA损伤率显著增加。结果表明,羧化BC和Pb联合作用对BEAS-2B细胞DNA损伤更为严重。为全面观察细胞凋亡,采用流式细胞仪检测暴露24小时后BEAS-2B细胞中羧化BC和/或Pb处理组的凋亡情况。结果显示与对照组相比,单独暴露于羧化BC或Pb处理组的BEAS-2B细胞凋亡率显著增加,而共暴露组的凋亡率显著高于单独暴露组。为了揭示羧化BC与铅共暴露诱导细胞凋亡的可能机制,在羧化BC(6.25μg/mL)和/或Pb(4μg/mL)作用24小时后,检测线粒体膜通透性(MMP),结果表明,与单一组分相比,羧化BC和Pb共暴露可引起线粒体去极化显著增加。为了进一步探讨细胞凋亡相关蛋白所产生的变化,用caspase活性检测试剂盒检测caspase-3、8、9的活性,发现单独暴露于羧化BC或Pb的BEAS-2B细胞中,caspase-3活性显著增强。此外,我们还评估了共暴露组氧化应激与凋亡标志物之间的相关性。这些结果表明ROS的产生与caspase-3和caspase-9的凋亡标记密切相关。将BEAS-2B细胞暴露于羧化BC和/或Pb环境中24小时,测定炎症细胞因子IL-6和TNF-α水平。共暴露组的炎性细胞因子水平明显高于单纯羧化BC或Pb处理组,提示羧化BC与Pb共暴露比单独暴露能促进炎症细胞因子的分泌。在IL-6的析因分析结果中观察到羧化BC和铅共暴露的协同作用,而在TNF-α中发现了加性作用。结论:本研究表明,低剂量羧化BC和Pb联合暴露可以引起人体支气管上皮细胞氧化应激、DNA损伤、凋亡和炎症的增强。此外,析因分析进一步证明,协同作用和加性相互作用是低剂量下羧化BC和Pb的联合毒性的原因。我们的数据还表明,羧化BC和Pb的共同暴露可以引起一些意想不到的毒性,甚至超过已知的低剂量单一污染物的毒性。本研究为大气污染物相互作用的研究提供了新的视角,为人类健康风险评价提供了生物学依据。