淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lymphocyte specific protein tyrosine kinase, Lck)是Src家族成员的蛋白酪氨酸激酶,主要存在于T淋巴细胞内,参与T细胞的发育、分化、活化的信号转导过程。国内外许多研究显示：Lck的异常表达和调节与细胞的癌变密切相关,如人淋巴细胞和非淋巴细胞恶性肿瘤均有Lck异常表达或激活,在转基因小鼠,Lck的表达导致胸腺肿瘤。Lck结构域中催化区含有两个可供调节的酪氨酸残基(tyr394和tyr505), tyr394是一自身磷酸化位点,可通过自身磷酸化作用使Lck激酶活性上调；tyr505的磷酸化则可使Lck激酶活性下调,若以不能被磷酸化的苯丙氨酸置换酪氨酸(Y505F)后,则出现Lck激酶活性的持续升高。但Lck介导肿瘤的发生的机制至今仍未能充分阐明。细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化,与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。活化的JAK催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰,STAT蛋白活化后以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合,调控基因的转录,包括SOCS基因的转录。因此,JAK-STAT信号转导通路参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。细胞因子信号抑制因子(suppressors of cytokine signaling, SOCS)家族是一类可被多种细胞因子诱导产生,且对细胞因子信号通路具有负反馈调节作用的蛋白分子。SOCS主要通过抑制JAK-STAT通路抑制信号转导,从而对细胞因子、激素、生长因子作用的强度和持续时间进行调控。SOCS主要通过以下三种不同的方式对细胞因子信号通路进行调节：第一,通过其SH2结构域与靶蛋白的磷酸酪氨酸结合,使JAK激酶的N末端失活而抑制信号转导；第二,抑制STAT与受体位点的结合；第三,通过SOCS盒促进所结合蛋白发生蛋白酶体依赖途径的降解。研究表明：SOCS1和SOCS3可能作用于持续性激活的酪氨酸蛋白激酶,或作为JAK/STAT通路的负调控因子,因而可能为肿瘤抑制因子。但SOCS在肿瘤发生中的作用有待进一步的研究。本研究首先建立了四环素诱导精确控制Lck激酶表达的T-REx(T-REx-293, T-REx-BaF3)细胞系统,转染组成型激活的Lck (Y505F)及STAT5b真核表达质粒,通过表达外源性Lck和STAT5,精确地研究Lck激活对STAT5的影响,且可进行互动免疫沉淀观察细胞内Lck与STAT5b蛋白质的相互作用。同时应用表达高水平Lck的小鼠淋巴瘤系LSTRA细胞及转染组成型激活Lck (Y505F)后转化的BaF3细胞,从细胞和分子等不同水平,系统观察了细胞增殖、细胞凋亡,信号蛋白间的相互作用、信号通路激活机制及SOCS1、SOCS3作为负性调控因子对JAK/STAT信号通路的影响。本文为阐明Lck蛋白酪氨酸激酶与JAK-STAT-SOCS信号通路在淋巴细胞和非淋巴细胞白血病的作用及机制提供实验依据,为白血病的防治提供一条新的线索。全文包括两部分：第一部分：组成型激活Lck (Y505F)致细胞恶性转化目的：研究组成型激活Lck (Y505F)激酶对细胞的转化作用及机制方法：利用加入四环素可去除pcDNA5/TO中启动子抑制因子,从而启动插入基因表达的T-REx-293细胞,转染组成型激活的Lck (Y505F)及STAT5b真核表达质粒,通过表达外源性Lck和STAT5,精确地研究Lck激活对STAT5的影响。用抗Myc抗体和抗STAT5抗体,免疫印迹法检测转染后Lck及STAT5蛋白的表达水平；抗STAT5抗体免疫沉淀法沉淀STAT5,用抗蛋白酪氨酸磷酸化抗体4G10观察Lck (Y505F)对STAT5b酪氨酸磷酸化的影响。收集短暂转染STAT5b真核表达质粒后24小时Lck (Y505F)转化的T-REx-293细胞,采用细胞外液低渗透压法提取核蛋白；用T4多聚核苷酸激酶将32P-ATP标记寡聚核苷酸；提取的核蛋白与32P标记的MGE一致序列的DNA结合后,进行电泳迁移率变动分析(EMSA法)实验,放射自显影观察Lck(Y505F)对STAT5b与DNA结合力的影响。以抗Lck抗体,抗STAT5抗体和蛋白A／G—琼脂糖微球,采取抗Lck抗体沉淀STAT5,抗STAT5抗体沉淀Lck的互动免疫沉淀法观察细胞内Lck与STAT5b蛋白质的相互作用。深入研究Lck (Y505F)对小鼠原B细胞系BaF3细胞生物学的影响。以细胞增殖,细胞凋亡为指标,通过台盼蓝染色用血细胞计数板计算BaF3细胞转染后2小时及24小时的细胞数。计存活细胞及死细胞数,计算细胞存活率及死亡细胞百分率。收集培养液中去除白介素-3后24小时Lck (Y505F)转化的BaF3细胞,用Alexa Fluor 647-conjugated Annexin V萤光染色,经FACSCantTM流式细胞仪分析,Quest软件采集数据分析细胞AnnexinⅤ阳性率,研究Lck (Y505F)对转化的BaF3细胞凋亡的影响。收集经电穿孔短暂转染质粒后24小时的BaF3细胞,用酚／氯仿抽提纯化,α-丙醇沉淀基因组DNA。1.2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。观察DNA断裂片断。为进一步研究STAT5b在Lck(Y505F)致细胞转化中的作用,T-REx-BaF3细胞转染WT型STAT5b和突变型STAT5b (Y699F)真核质粒,表达STAT5或主域负性蛋白STAT5b,观察WT型STAT5b和突变型STAT5b (Y699F)对Lck(Y505F)细胞增殖及凋亡的影响。结果：Lck的表达12小时达高峰并维持至24小时,作为阴性对照,转染载体的T-REx-293细胞无Lck的表达；抗STAT5抗体免疫沉淀STAT5后,蛋白酪氨酸磷酸化抗体4G10的免疫印迹显示：Lck可促进STAT5b酪氨酸磷酸化,从而激活STAT5b。Lck可促进STAT5b与32P标记的MGE一致序列的DNA的结合,未用32P标记的寡聚DNA无结合及加入STAT5b抗体出现超迁移现象,证明STAT5b与DNA结合具有特异性。结果显示Lck可激活STAT5b,促进STAT5b与DNA结合力增加。互动免疫沉淀试验结果表明：T-REx-293细胞中共同表达外源性Lck和STAT5b后,用抗STAT5b抗体免疫沉淀后可沉淀Lck蛋白,反之,用抗Lck抗体进行的免疫沉淀可沉淀STAT5b,由此可见,细胞中Lck和STAT5b结合在一起,故Lck和STAT5b在细胞中存在蛋白间的相互作用,Lck可能直接激活STAT5b。这也表明组成型激活的Lck (Y505F)可激活STAT5b。表达Lck (Y505F)后第一、二、三天BaF3细胞计数量均明显增加(P<0.05及P<0.01),结果表明Lck激活促进BaF3细胞增殖。BaF3的生长依赖于白介素-3,去除培养液中的白介素-3后,BaF3细胞可发生细胞凋亡。转染载体的BaF3细胞在去除培养液中白介素-3后至第六天几无存活,而转染Lck(Y505F)真核表达质粒的BaF3细胞在去除培养液中白介素-3后,前三天存活率下降,但其降幅明显低于载体对照(P<0.01及P<0.001),第四天后细胞存活率明显增加,至第六天细胞存活率恢复至去除白介素-3的水平,BaF3细胞能独立于白介素-3的刺激生长。转染Lck的BaF3细胞Annexin V阳性率明显减低(P<0.01)；DNA断裂片断也明显减少。结果表明Lck激活可促进BaF3细胞抗凋亡。T-REx-BaF3细胞短暂转染WT STAT5b或STAT5b (Y699F)后可表达等量的STAT5b蛋白。与转染载体质粒相比,转染WT型STAT5b质粒可促进BaF3细胞增殖,与之相反,主域负性STAT5b (Y699F)则抑制Lck激活诱导的细胞增殖(p<0.05及P<0.01)。去除培养液中的白介素-3后,与转染载体质粒相比转染WT型STAT5b质粒的BaF3细胞死亡率明显降低(P<0.05),而转染主域负性STAT5b (Y699F)质粒的BaF3细胞死亡率明显增加(P<0.05),结果显示STAT5b在Lck激活诱导的细胞生物学中发挥重要的下游信号分子作用。结论：组成型激活的Lck (Y505F)诱导STAT5b的酪氨酸磷酸化,激活STAT5b;促进STAT5b与DNA结合力增加；Lck与STAT5b在细胞内相互作用。转染Lck (Y505F)促进BaF3细胞增殖,抵抗去除IL-3诱导的细胞凋亡,而主域负性蛋白STAT5b (Y699F突变)逆转Lck (Y505F)的促细胞增殖及抗凋亡作用。因此,Lck通过STAT5b的激活导致细胞恶性转化。第二部分SOCS1和SOCS3抑制Lck (Y505F)导致的细胞转化目的：研究SOCS1和SOCS3对抑制Lck (Y505F)导致的细胞转化的抑制作用方法：小鼠T细胞系LSTRA淋巴瘤细胞(过度表达Lck激酶),用32P标记的全长cDNA以Northern杂交分析法检测中SOCS1, SOCS3, Bcl-xL, GAPDH的表达；观察用过钒酸钠(酪氨酸激酶激活剂)刺激LSTRA细胞后SOCS1,SOCS3的表达变化；用5-’氮杂胞苷(DNA甲基抑制剂)处理LSTRA和U266细胞,采用RT-PCR法检测5′-氮杂胞苷处理后LSTRA细胞SOCS1 mRNA表达水平。用电穿孔法将pEF, pEF-FLAG-Ⅰ/mSOCS1, pEF-FLAG-Ⅰ/mSOCS3真核表达质粒短暂转染入Lck (Y505F)转化的BaF3细胞。以细胞增殖,细胞凋亡为指标,通过台盼蓝染色用血细胞计数板计算BaF3细胞转染后2小时及24小时的细胞数。计存活细胞及死细胞数,计算细胞存活率及死亡细胞百分率。收集经电穿孔短暂转染pEF, pEF-FLAG-Ⅰ/mSOCS1, pEF-FLAG-Ⅰ/mSOCS3质粒后24小时BaF3细胞,用Alexa Fluor 647-conjugated AnnexinⅤ萤光染色,经FACSCantoTM流式细胞仪分析,Quest软件采集数据分析细胞AnnexinⅤ阳性率,观察SOCS1, SOCS3对细胞凋亡的影响。收集经电穿孔短暂转染质粒后24小时的BaF3细胞,用酚／氯仿抽提纯化,α-丙醇沉淀基因组DNA。1.2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。观察DNA断裂片断,进一步检测SOCS1, SOCS3对细胞凋亡的影响。收集经电穿孔短暂转染pEF, pEF-FLAG-Ⅰ/mSOCS1, pEF-FLAG-Ⅰ/mSOCS3质粒后24小时BaF3细胞,用抗Myc抗体和抗Flag抗体免疫印迹法检测全细胞裂解液中外源性Lck和SOCS蛋白的表达水平。用抗Lck抗体免疫沉淀Lck,测定体外激酶活性(IVK),观察SOCS1, SOCS3对Lck激酶的抑制作用。收集经电穿孔短暂转染pEF, pEF-FLAG-Ⅰ/mSOCS1, pEF-FLAG-Ⅰ/mSOCS3质粒后24小时BaF3细胞,采用细胞外液低渗透压法提取核蛋白；用T4多聚核苷酸激酶将32P-ATP标记寡聚核苷酸；提取的核蛋白与32P标记的MGE一致序列的DNA结合后,进行电泳迁移率变动分析(EMSA法)实验,放射自显影观察SOCS1, SOCS3对Lck (Y505F)转化的BaF3细胞STAT5b与DNA结合力的变化。免疫印迹检测转染后Lck及STAT蛋白的表达水平,用抗STAT5b抗体和蛋白A／G-琼脂糖微球,免疫沉淀法沉淀STAT5,用抗蛋白酪氨酸磷酸化抗体4G10测定SOCS1, SOCS3对Lck (Y505F)转化的BaF3细胞STAT5b酪氨酸磷酸化的影响。结果：使用SOCS1和SOCS3全长cDNA探针,没有检测到LSTRA细胞中SOCS1和SOCS3 mRNA的表达。与此结果相似,EL4细胞,表达正常水平Lck的小鼠T细胞系也没有检测到SOCS1和SOCS3基因的转录。而作为阳性对照,白介素-3刺激强烈激活BaF3细胞SOCS1和SOCS3基因的表达。表明SOCS1和SOCS3基因在LSTRA细胞中表达缺失。过钒酸钠处理LSTRA细胞15min-2h,利用Northern杂交检测SOCS1和SOCS3基因的表达。过钒酸钠刺激LSTRA细胞1-2h后可检测到SOCS3基因的表达,显示LSTRA细胞启动SOCS3基因表达的机制仍然完好无损。而在过钒酸钠刺激的LSTRA细胞,观察的时间内未检测到SOCS1的表达,说明SOCS1基因沉默可能是通过DNA甲基化而发生。用DNA甲基抑制剂5-’氮杂胞苷抑制DNA甲基化的影响,采用RT-PCR分析显示5’-氮杂胞苷处理可重新激活SOCS1基因表达,但未经处理或溶剂对照处理LSTRA细胞无此现象。因此,通过酪氨酸激酶激活剂过钒酸钠刺激LSTRA细胞及DNA甲基抑制剂5-’氮杂胞苷处理LSTRA的研究表明：DNA甲基化介导SOCS1的基因沉默,而SOCS3表达缺失的机制独立于DNA甲基化。与载体相比,短暂转染SOCS1和SOCS3真核表达质粒的Lck (Y505F)转化的BaF3细胞增殖明显降低,细胞死亡明显增加(P均<0.001)；Annexin V阳性细胞百分比明显增加(P<0.001)；DNA断裂形成也明显增加。提示SOCS1和SOCS3抑制Lck转化的BaF3细胞增殖及促进细胞凋亡转染空载体质粒的Lck转化的BaF3细胞中由于Lck (Y505F)自身磷酸化激活致掺入的32P明显增加。短暂转染SOCS1和SOCS3真核表达质粒的Lck(Y505F)转化的BaF3细胞磷酸化明显降低。Lck转化的BaF3细胞核提取物与STAT5的一致序列DNA体外结合明显增加。与空载体质粒相比,短暂转染SOCS1和SOCS3真核表达质粒的Lck(Y505F)转化的BaF3细胞STAT5b与DNA的结合明显降低。STAT5b免疫沉淀结果显示转染空载体质粒的Lck转化的BaF3细胞中有较高水平的酪氨酸磷酸化。同样,表达SOCS1或SOCS3明显降低STAT5b酪氨酸磷酸化水平。结果提示：表达SOCS1和SOCS3可以降低Lck的转化BaF3细胞中Lck (Y505F)下游的STAT5b活动。结论：SOCS1和SOCS3 mRNA在LSTRA淋巴瘤细胞中因基因沉默而表达缺失,DNA甲基化介导SOCS1的基因沉默；而SOCS3表达缺失的机制独立于DNA甲基化。SOCS1和SOCS3显著抑制Lck转化的BaF3细胞增殖及促进细胞凋亡：明显降低Lck (Y505F)转化的BaF3细胞中Lck自身磷酸化；抑制Lck(Y505F)转化的BaF3细胞STAT5b与DNA的结合；明显降低STAT5b酪氨酸磷酸化水平。SOCS1和SOCS3可以抑制Lck的转化BaF3细胞中Lck及下游的STAT5b活动。因此,SOCS1和SOCS3逆转Lck (Y505F)介导的BaF3细胞的恶性转化。