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为了提高我国酸奶的品质和生产水平，缩小与发达国家在直投式酸奶发酵剂的差距，本课题对酸奶菌种（嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌）的大量菌珠进行选育，并从工业化生产的角度考虑系统研究了高活力乳酸菌发酵剂增菌、冷冻干燥，多菌种组合的机理和工艺条件。结果如下： 1．乳酸菌菌株的分纯及选育 由不同来源商业发酵剂BS和直投式发酵剂DVI在特定培养基上划线分纯，得到20珠球菌、12珠杆菌。菌株经活化后连续五代发酵脱脂乳，综合考虑酸度、pH值、感官、粘度和和凝固时间各项指标，选出六株杆菌分别为：350L、380L、TM-111L、V1L、95L及前期优选B3L，球菌五株分别为：TM-111S、900S、96S、YC380、SH9。经形态学和生理生化初步鉴定，可以初步判定所选择的球菌为嗜热链球菌，杆菌为保加利亚杆菌。 将优选出的球菌和杆菌以1：1混合发酵脱脂乳，根据滴定酸度、pH值和粘度选出发酵性能最好的球菌和杆菌组合为：TM-111S与TM-111L、900S与95L、900S与TM-111L、900S与V1L、TM-111S与B3。 2．优选的保加利亚杆菌菌株紫外诱变及驯化 对保加利亚杆菌B3、TM-111L进行紫外菌种诱变选育，选取致死率为80～90％的紫外照射条件为：选择在20w紫外灯，菌悬液距紫外光源30cm，照射2min。经过复筛选出4株对低酸敏感的保加利亚乳杆菌，但经过第一次传代，只有一株显示了对酸度敏感，而经过第二次传代，所有诱变的保加利亚乳杆菌菌珠对酸度敏感的特性都全部丧失。 3．高活力乳酸菌的增殖培养 根据优选L.b和S.t在经典培养基中生长，选定S.t和L.b增菌培养基的基质为：4％脱脂乳和5％的酶解乳清（水解时间60min，1：1配合）。通过增殖因子的单因素试验效果和正交试验确定增菌培养基（1）S.t最佳配方为：5％蕃茄汁、0.7％酵母粉、5％麦芽汁；2％乳糖、0.5％缬氨酸、1％碳酸钙。（2）L.b最佳配方为：5％番茄汁、5％麦芽汁、0.7％酵母粉；2％乳糖、70mg/kg甲酸。 另外，补加10％Gq可以提高球菌的活力。 控制发酵过程温度、pH值，对乳酸菌的产酸活性影响很大，其中球菌更适合在PH值较高（6.1）、温度为41℃条件下生长；杆菌更适合在pH值较低（5.7）、温度为41℃条件下生长。采用磷酸盐缓冲液在菌生长高峰期缓冲能力不能满足需要，不适合产酸量大的乳酸菌增殖。增菌过程充气体N2、CO2，对菌体并无提高。 运用三因素二次饱和D-最优化设计（311A），得到球菌S.t培养条件的回归方程为：y=-83.07+2.40x1+10.15x2+0.99x3+0.03x1x2-0.02x1x3+0.02x2x3-0.03x12+0.03x22-0.04x32在培养温度41.8℃，pH值6.1、培养时间4.6h可获得最大产乳酸活力0.59％。运用三因素二次饱和D-最优化设计（311A），得到杆菌L.b培养条件回归方程为：y=-67.58-1.79x1+9.57x2+0.82x3+0.02x1x2-0.01x1x3-0.02x2x3-0.02x12-0.88x22-0.04x32在培养温度42.5℃、pH值5.9、培养时间4.7h，可获得最大产酸活力0.50％。 按照优选增菌培养基和条件在全自动发酵罐中增菌，结果＊上菌产酸活力在4h后下降；而SJ菌在增殖3．5～4h后，球菌的产酸活力下降。对增菌过程中菌体特征观察可以发现，在产酸活力达到最高之前（4h）L上为短而直的杆状，达到最高产酸活力后菌体为长而弯曲的杆状，并且在菌体内有着色不均匀的颗粒。 将球、杆菌混合组成酸奶发酵剂，以球菌增菌4．sh、杆菌增菌3．sh发酵脱脂乳的产酸活力最高；另外，从各增菌阶段的杆菌与增菌4刀～4．sh的球菌混合其发酵活力无明显差别可以看出，杆菌的最初活力在实验范围内对酸奶发酵剂的活力影响不大。增菌培养基中增殖的发酵剂其产酸活力明显高于传统发酵剂的巾＜0刀5)，这证实实验所选的增菌培养基是有效的。 将球菌和杆菌以初菌数1＊比例混合在增菌培养基中，无论温度如何都遵循球菌先迅速生长，而在温度38C～44oC培养球菌数量始终占优势；Zh后杆菌比例增加趋于平衡，这一变化规律受培养温度影响，较高温度培养有利杆菌生长，而使球杆菌比例达到平衡的时间较短。较高pH值6刀有利于混合培养的总菌数增加，但是球菌杆菌比例不平衡，即球菌的数量远远高于杆菌；较低pH值培养总菌数低，但球杆菌比例随培养时间延长而趋向于平衡。 4．营养物质及代谢产物对曹体生长的影响 在发酵过程中乳糖消耗量约为中和用氢氧化钠的4倍，因此在乳酸菌增菌过程中根据NaOH的消耗量补加乳糖是必要的。补加乳糖量为：保加利亚乳杆菌（Lb）为碱量的4倍 （按重量比）即可满足需要；而嗜热链球菌（S【）则在优选培养基之中再加 1％的乳糖，并在增菌过程中以4倍碱的量补加乳糖可获得更高的菌活力． 将增菌发酵液分做抑菌试验，通过测定抑菌圈证实增菌过程中发酵液对菌体本身有抑制作用，这种抑制作用随着发酵时间的延长而增强：球菌在增菌培养基中发酵3刀h，杆菌在增菌培养基中发酵4h后其发酵液对自身菌的抑菌能力明显增强。通过添加 Ca（LC）。和 Na（LC）可知，中和剂对微生物菌体有抑制作用。同时 SDS－聚丙烯酚胺凝胶电泳分析发现在发酵液中有nisin成分的低分子蛋