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植物内生真菌是天然活性物质的重要来源,通常人们采用大规模发酵培养工业化生产其活性成分,由于活性成分产率低且不稳定常常限制了其工业化进程,通过代谢调控能有效提高活性物质的产量,满足工业生产需求。本论文以杨树内生真菌Ponipodef12(Hyalodendriella sp.Ponipodef12)为研究对象,通过多种次生代谢产物调控途径,优化培养条件,以提高该菌产生的两个主要的二苯并-α-吡喃酮类化合物Botrallin和TMC-264的产量。主要结果如下。1、采用添加大孔吸附树脂的两相培养技术对内生真菌Ponipodef12中产二苯并-α-吡喃酮类化合物的培养过程进行优化。首先对13种不同类型的大孔吸附树脂进行了初步筛选,筛选出大孔吸附树脂DM-301最有利于促进内生真菌Ponipodef12中化合物Botrallin和TMC-264的产生,Botrallin和TMC-264的产量分别达到27.98 mg/L和33.86 mg/L,分别是对照的1.43倍和8.98倍。在此基础上,进一步对大孔吸附树脂DM-301的添加量、添加时间以及添加后的收获时间进行了筛选和优化。经优化的树脂添加浓度、添加时间及收获时间分别为:大孔吸附树脂DM-301以添加浓度为4.38%(3.5 g/80 mL培养基),在内生真菌Ponipodef12发酵培养的第24 d添加,共培养4d后收获,即第28 d收获,化合物Botrallin的产量达到最大值(51.47 mg/L),为对照的2.29倍,而TMC-264产量则是在第30 d(即共培养了 6 d)收获达到最大值(47.74 mg/L),是对照的11.76 倍。2、利用单因素方法筛选不同金属离子对内生真菌Ponipodefl2中化合物Botrallin和TMC-264产量的影响,确定了有利于内生真菌Ponipodef12中化合物Botrallin和TMC-264产量提高的最佳金属离子为Zn2+、Cu2+和Mg2+。进一步利用中心组合设计(CCD)结合响应面分析法(RSM)对这三个重要因素进行了优化,分别得到了这3种离子适宜于内生真菌Ponipodef12中化合物Botrallin 和 TMC-264 产量提高的最佳配比(Zn2+:0.83 mmol/L;Cu2+:0.20 mmol/L;Mg2+:0.12 mmol/L),可使化合物Botrallin和TMC-264的产量均达到最大,分别为146.51和36.63 mg/L。3、利用单因素方法筛选不同细菌激发子对内生真菌Ponipodef12中化合物Botrallin和TMC-264产量的影响,确定了最有效提高内生真菌Ponipodef12中化合物Botrallin和TMC-264产量的细菌激发子为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus,St-ha)。研究该菌的胞外和胞内多糖,高压灭菌的St-ha培养液,高压灭菌后过滤除掉菌体的纯培养液,以及正常含St-ha的培养液和过滤除掉菌体的纯培养液对内生真菌Ponipodef12中化合物Botrallin和TMC-264产量的影响。发现细菌St-ha-活菌液(即无菌过滤除掉菌体的纯菌液)对化合物Botrallin和TMC-264的产生促进作用最大,St-ha-活菌液添加量为1.25%时,化合物Botrallin产量达到最大(49.79 mg/L),是对照的2.19倍;St-ha-活菌液添加量为6.25%时,TMC-264的产量达到最大(15.44mg/L),是对照的2.69倍。4、利用单因素方法研究了 pH、磷酸盐(K2HPO4·3H2O)、醋酸盐(CH3COONa)及氯化钠(NaCl)对内生真菌Ponipodef12中化合物Botrallin和TMC-264产量的影响。发现这4个因子对内生真菌Ponipodef12中化合物Botrallin和TMC-264的产生均有显著影响。结合前期筛选的最佳金属离子Zn2+,利用Box-Behnken设计(BBD)结合RSM优化这5个因子(pH、K2HP04·3H20、NaCl、CH3COONa 及 ZnS04.7H20)最有利于内生真菌 Ponipodef12 中化合物 Botrallin 和 TMC-264产量提高的浓度配比,分别建立了化合物Botrallin和TMC-264产量与研究变量之间的二次多项回归模型,利用相应的模型确定了最有利于化合物Botrallin和TMC-264产生的5个因子的最佳条件配比为:pH 为 5、K2HP04·3H20 为 1.75 g/L、NaCl 为 0.25 g/L、CH3COONa 为 0.01 g/L 及ZnS04.7H2O为0.02 g/L,此时化合物Botrallin和TMC-264的产量均达到最大,分别为86.95 mg/L和 15.84 mg/L。5、将 5 个因子(pH、K2HP04·3H20、NaCl,CH3COONa 及 ZnS04·7H20)与前期筛选的最佳大孔吸附树脂DM-301及最佳细菌诱导子金黄色葡萄球菌结合,总共设了 8个不同处理,即PDB液体培养基(PDB),含有5个因子的PDB液体培养基(PDB-5),含有细菌金黄色葡萄球菌的PDB液体培养基(PDB-B),含有5个因子和细菌金黄色葡萄球菌的PDB液体培养基(PDB-5-B),含有树脂DM-301的PDB液体培养基(PDB-R),含有5个因子和树脂DM-301的PDB液体培养基(PDB-5-R),含有细菌金黄色葡萄球菌和树脂DM-301的PDB液体培养基(PDB-B-R)及含有5个因子、金黄色葡萄球菌和树脂DM-301的PDB液体培养基(PDB-5-B-R)。研究结果表明不同的处理对Botrallin和TMC-264的产量具有不同的影响。其中,PDB-5-R的处理对Botrallin的产生促进作用最为明显,Botrallin产量达到80.83 mg/L,为对照的3.71倍。而TMC-264的产量在PDB-5-B-R的处理中达到最大(10.84mg/L),为对照的2.02倍。本论文结果明确了有效提高菌株Ponipodef12二苯并-α-吡喃酮类活性次生代谢产物Botrallin和TMC-264产量的途径,为采用生物技术手段大规模生产Botrallin和TMC-264提供了依据,为其应用奠定了基础。