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对硝基苯酚磷酸酶(p-nitrophenylphosphatase,pNPPase),是一种Mg2+依赖性的专一性碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AP),作用底物为对硝基苯酚磷酸盐(p-nitrophenylphosphate,pNPP),产物为对硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)和无机磷酸盐。来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophlius)的耐热对硝基苯酚磷酸酶(Thermo p-nitrophenylphosphatase,TpNPPase)具备耐热、耐有机溶剂等优点,有更广泛的实际应用价值,同时也是研究蛋白质热稳定机制的良好材料。 本研究使用了基于随机诱变和热处理的定向进化,得到了2个耐热对硝基苯磷酸酶的热稳定性提升突变体,H170Y和Q173G。对H170Y与Q173G的酶学性质与热稳定性进行了基本的测定,发现它们与野生型相比,T1/2、Tm值都有提高。其中,H170Y的T1/2、Tm值分别提高了3.28℃和2.39℃,Q173G的T1/2、 Tm值分别提高了3.27℃和3.00℃。 为了研究蛋白结构与其热稳定性之间的关系,使用气相悬滴扩散法结晶了H170Y与Q173G。通过X射线衍射,最终收集到了H170Y分辨率为2.0(A)、Q173G分辨率为1.9(A)的衍射数据。以野生型TpNPPase结构为模板,采用分子置换法进行结构解析,成功获得了H170Y与Q173G的三维结构。在H170Y的晶体结构中捕获到了作为辅酶Mg2+类似物的Na+,与作为产物PO43-类似物的SO42-的电子云密度,观察到TpNPPase蛋白Cap结构域介于“开”与“关”之间的过渡构象。 结构分析表明,蛋白表面新增的疏水作用是H170Y的热稳定性提升的主要原因,同时,溶剂可及表面积的减小很可能是Q173G蛋白热稳定性提升的重要因素。本研究不仅为TpNPPase的催化机制提供了分子基础,同时也将为蛋白质的耐热机制研究提供依据。