苦荞中新型糖蛋白的制备、固定化及对茶汤的影响

来源 :昆明理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wudixuejie
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苦荞(Fagopyrum tartaricum(L.)Gaertn)是蓼科中荞麦属的主要物种之一,具有重要的经济和药用价值,深受国内外人民的喜爱。糖蛋白是生物体内一种高效的生物活性物质,具有极其重要的生理功能,因此从营养价值丰富的苦荞中提取出糖蛋白,并进一步研究它的结构、性质,以及探索它的功能特性有重要的理论和现实意义。本文以脱脂苦荞粉为原料,先后通过水提醇沉、除蛋白、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-100分子排阻层析后得一新型糖蛋白BGP4-I。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效凝胶渗透色谱(HPGPC)检验其纯度,达到结构表征及应用研究级别,其平均分子量约为123.43 kDa,最终得率为2.31%。利用差示扫描量热(DSC)、扫描电镜(SEM)、氨基酸自动分析、紫外光谱(UV)、红外光谱(FTIR)、圆二色性(CD)、核磁共振(NMR)、串联质谱等分析方法对BGP4-I的结构进行了表征。结果显示BGP4-I表面光滑,结构紧密,具有较高的热稳定性;其含有17种一般氨基酸,富含谷氨酸和天冬氨酸;碳水化合物组分主要成分为岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡糖胺。此外,通过使用β-消除反应证明了BGP4-I中O-糖肽键的存在;CD光谱的解卷积表明存在α-螺旋和β-结构;血细胞凝集试验结果表明BGP4-I不是凝集素。最后,基于Nano LC-ESI-MS/MS分析氨基酸序列和以对硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷(pNPG)作为底物测定酶活性,BGP4-I被鉴定为一种新型的β-葡萄糖苷酶。以戊二醛(GA)交联二氧化硅和胺基双功能化Fe3O4纳米粒子(Fe3O4@SiO2–NH2-GA)为载体对BGP4-I进行固定化,固定化产率为90.98%。通过FTIR和场发射-扫描电镜(FE-SEM)对固定化BGP4-I的形貌和结构进行表征,并且对固定前后BGP4-I的最适反应条件、稳定性、动力学等酶学性质进行了测定。实验结果表明:固定前BGP4-I显示出相对耐酸嗜热,且对某些底物的特异性是独特的,固定后BGP4-I对pH和温度的耐受性明显增强。固定前BGP4-I的Km和Vmax值分别为31.28 mM和286.53μmol/min,固定后BGP4-I的Km和Vmax值分别为43.03 mM和284.9μmol/min。在重复使用7个循环后,固定化BGP4-I显示出51.8%的残余活性,而当分别在4℃和25℃下储存15 d后,固定化BGP4-I亦能保存约81%和60%的残余活性。将固定化BGP4-I作用于绿茶和红茶茶汤中,气相色谱-质谱法(GC-MS)测定其特殊性挥发成分和含量,发现无固定化BGP4-I作用和固定化BGP4-I作用的茶汤,特征性挥发性成分的含量有明显的变化,绿茶和红茶茶汤分别提高了约16%和48%。此外,在茶汤本身富含黄酮苷的基础上,固定化BGP4-I的作用促使绿茶和红茶茶汤中杨梅素、山奈酚和槲皮素等黄酮类糖苷配基的含量分别增加了约65倍和5倍。综上所诉,茶汤的固定化BGP4-I辅助加工是增强香气成分含量和有效水解黄酮苷以释放黄酮类糖苷配基的一种绿色和可持续的方法,该方法可提高茶汤的整体风味品质以及天然活性物质的生产和利用。
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