鸡肝蛋白中氨基酸构成均衡,是一种优质完全蛋白,在鸡肝中含量近20 %。我国鸡肝每年产量高达50余万吨,多以鲜销或者作为动物、水产饲料资源加以利用,提高其附加值的深加工利用很少,没有充分体现其应有的价值。究其原因是由于人们对鸡肝的加工特性了解不多,尤其是对其中高含量的、种类繁多复杂的鸡肝蛋白研究甚少。如何把低值鸡肝中的优质蛋白提取,弄清其主要加工特性和机制,并应用到食品工业中,便显得很有意义和价值。ISP (等电点溶解/沉淀法,Isoelectric Solubilization/Precipitation )技术因具有高提取率、安全和无污染等显著优点,在提取水产品、鸡肉和机械去骨火鸡肉等原料中的蛋白的应用已非常多,且对水产品的蛋白提取已实现工业化生产,但ISP技术对鸡肝蛋白的提取和其乳化特性有何影响?其乳化特性形成机制是怎样的需要弄清和明确。非标记液相色谱-串联质谱蛋白质组学定量(Label-free LC MS/MS)技术在复杂蛋白质研究中具有明显优势。本论文探究了用ISP技术提取的鸡肝蛋白的提取率和理化特性,并重点研究ISP技术提取的鸡肝蛋白的乳化特性及其形成机理。结合蛋白组学的研究,进一步辅助阐明了ISP鸡肝蛋白的乳化形成机制,为ISP技术提取的鸡肝蛋白在食品工业中的应用提供理论依据和技术支持。本文的主要研究内容和结果如下:1.正常和异色新鲜鸡肝理化与营养品质的比较研究评价了正常和异常颜色鸡肝理化和营养品质的差异以及其安全性,为两种鸡肝的食用和进一步加工利用提供科学依据。试验采取不同批次同品种的鸡肝,分别测量其-主要化学成份、pH、总色素含量、脂肪酸、氨基酸构成、矿物质元素及重金属含量。结果表明:正常颜色的鸡肝蛋白质和水分含量极显著高于异常颜色的鸡肝(P< 0.01 ),而脂肪和灰分含量极显著低于异常颜色的鸡肝(P< 0.01) , pH值和总色素含量正常颜色鸡肝也均显著高于(P< 0.05)异常颜色鸡肝;相比异常颜色鸡肝,正常颜色鸡肝含有大量多不饱和脂肪酸(PUFA) (P< 0.05 ),较高的饱和脂肪酸(SFA ),但PUFA/SFA值(为0.453 )也显著(P< 0.05 )较高;正常颜色鸡肝与异常颜色鸡肝相比,有7种氨基酸构成差异显著(P< 0.05),其中丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、赖氨酸和组氨酸这5种氨基酸百分含量显著高于异常颜色鸡肝(P< 0.05);正常颜色的鸡肝钾、钠、磷、铜、铁和硒的含量显著(P< 0.05)高于异常颜色的鸡肝,而异常颜色鸡肝中钙含量显著高于正常颜色组(P < 0.05)。两种鸡肝中都检测出高含量的铁和锌,以及一定含量的硒;虽然在两种颜色的鸡肝中都检测到了铅和镉,但含量极低,符合食品安全限量规定。尽管正常颜色鸡肝比异常颜色鸡肝具有较高的营养价值,但都是安全可食用的副产物。2.鸡肝乳化过程中蛋白构象变化与保油保水性的关系研究通过拉曼光谱和低场核磁共振技术,探讨了鸡肝酱糜在不同介质(葵花籽和芥花混合油替代0%～40%猪背膘,结合预乳化和新鲜鸡肝斩拌乳化)乳化过程中蛋白质结构和水分分布的变化。结果表明:预乳化猪背膘和用超过20 %植物油替代猪背膘,增加了水油结合能力,形成更均匀细腻的微观结构,并且NMR弛豫时间(T21a、T21b和T22)逐渐降低,这主要是由于鸡肝酱糜中低的汁液损失。拉曼光谱结果表明,当预乳化的植物油替代比例达到20 %～40 %时,和对照组相比,鸡肝酱糜的α-螺旋含量下降,并伴随着β-折叠结构含量上升。鸡肝酱糜中色氨酸和酪氨酸的双峰疏水残基比例也受预乳化和植物油替代的影响,从而揭示了鸡肝蛋白和预乳化植物油形成稳定乳化液的形成机制。3. ISP鸡肝蛋白提取率及其组分构成研究研究鸡肝经过酸(pH 2.0、2.5、3.0 和 3.5)和碱(pH 10.5、11.0、11.5 和 12.0)溶解、pH 5.5沉淀时鸡肝蛋白的提取效率和回收蛋白的组分。研究结果表明:蛋白提取率最高在pH 2.0、11.5和pH 12.0,回收率分别达到77.90%、78.38%和79.29%。pH 3.5时的提取率最低(58.53 % )。pH 3.0和pH 3.5有利于提取盐溶蛋白,而pH 10.5、.11.0和11.5提取更多的是水溶性蛋白,ISP方法能提取更多的不溶性蛋白。酸提取的总色素含量显著高于碱处理样品(P<0.05) , pH2.5时的总色素含量最高。除pH2.0组外,碱溶解提取的鸡肝蛋白粒径D10、D50、D90、D3,2和D4,3值均显著高于酸提取组(P< 0.05 ),且随pH值增大而显著增加(P< 0.05 )。ISP除对赖氨酸和半胱氨酸构成有影响外,对其它氨基酸构成无影响(P>0.05),必需氨基酸与总的氨基酸比值也差异不显著(P> 0.05)。SDS-PAGE条带表明和酸处理相比,碱处理得到的肌球蛋白重链(MHC)和肌动蛋白含量高。因此,利用ISP处理回收高值蛋白资源的方法将为开发具有功能特性的新产品提供便利,并且可以拓展鸡肝脏的利用价值。4. ISP鸡肝蛋白乳化特性及其构象变化的研究通过测定酸(pH2.0、2.5、3.0和3.5)、碱(pH 10.5、11.0、11.5和 12.0)加工提取的鸡肝蛋白以及原料鸡肝分别与植物油乳化后的乳化稳定性、活性、黏度和光学显微结构等,比较研究了它们乳化特性的差异。并应用拉曼光谱技术研究了 ISP提取的鸡肝蛋白在乳化过程中的构象变化对乳化特性的影响机制。研究结果表明:相比酸溶解提取的鸡肝蛋白组,碱溶解鸡肝蛋白组具有显著高的乳化稳定性、乳化活性和黏度(P < 0.05 ),其中pH 11.0溶解提取的鸡肝蛋白组的乳化特性甚至好于原料鸡肝蛋白,具有最大的乳化稳定性、乳化活性和黏度(P<0.05),其次是pH 11.5。pH 2.5和3.0组具有最小的乳化稳定性、乳化活性和黏度(P< 0.05)。除pH 2.0组外,碱提取组(pH 11.0、11.5和12.0)的乳化液粒径D3,2、D4,3、D10、D50和D90值都大于酸提取组,这是由于碱溶解能提取较大粒径蛋白引起的缘故。ISP鸡肝蛋白以及原料鸡肝的乳化液的光学显微图显示,酸溶解提取的鸡肝蛋白乳化液具有相对较大的不规则液滴,且呈不规则分布,液滴与液滴之间表现出凝集的相连现象,尤其是pH 3.0表现的很明显。碱溶解提取的鸡肝蛋白,则表现出了明显相对较小的球状液滴,且在连续相中均匀分布,pH 11.0组表现的尤为明显,这种液滴均匀一致地分布有利于形成稳定的乳化液。乳化层的拉曼光谱显示,相比原料鸡肝,ISP蛋白乳化后均涉及二级结构的改变,其中碱溶解组α-螺旋含量显著减少(P<0.05) , β-折叠增加。酸溶解组α-螺旋含量也显著减小(P< 0.05),但β-折叠也减少了,无规则或随机卷曲结构含量显著增加(P<0.05)。β-折叠的增加则有利于形成稳定乳化液,与保油保水性的提高有很大关系。ISP增加了扭式-扭式-反式的二硫键构象,碱溶解组g构象也显著增加(P< 0.05) ISP后,乳化时会使色氨酸残基从极性的暴露状态向包埋状态转变,酪氨酸残基是暴露的或是能够参与中度或弱的氢键形成。碱溶解的蛋白质侧链在乳化反应过程中表现出很强的活性,甲基和亚甲基被包埋,暴露了疏水性氨基酸,造成了疏水相互作用增强,从而增加了乳化稳定性。5. ISP鸡肝蛋白乳化过程中的非标记液相色谱-串联质谱蛋白质组学定量研究采用ISP提取的鸡肝蛋白与植物油乳化后,提取乳化层中的蛋白,利用非标记液相色谱-串联质谱(Label-free LC MS/MS)蛋白质组学定量技术研究参加乳化的蛋白种类和数量,并对蛋白进行功能注释。研究结果表明,9组样品乳化层中的蛋白归并后共鉴定到 2662 种蛋白质,pH 2.0、2.5、3.0、3.5、10.5、11.0、11.5、12.0 和原料鸡肝中分别鉴定出:1729、1724、1783、1728、1923、2218、2110、2092 和 1477 种蛋白,pH 11.0乳化层中参加乳化蛋白质种类最多、其次是pH 11.5和12.0,原料鸡肝组最少。各组中高丰度蛋白的种类和数量各不相同,每组前20个高丰度蛋白中独有的蛋白个数分别为3个(pH 2.0组)、3个(pH 2.5组)、6个(pH 3.0组)、2个(pH 3.5 组)、3个(pH10.5组)、1 个(pH11.0组)、1 个(pH11.5组)、3 个 (pH 12.0组)和0个(原料组)。与原料鸡肝组相比,其它各组前20个高丰度蛋白的含量差异倍数完全不同。相比酸溶解组间或碱溶解组间乳化层中显著差异蛋白的数量,碱溶解组与酸溶解组之间均较大,差异蛋白的聚类分析也表现出基本一致的趋势。