防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)FD6分离自福建省闽侯青口青菜根围,对番茄灰霉病具有很好的防病效果。温室番茄果实上的灰霉病防效试验表明,防御假单胞菌FD6的防效达到72.60%,显著高于解淀粉芽孢杆菌W10和化学药剂腐霉利。2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetyphloroglucinol,2,4-DAPG或PHL)和藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin,PLT)是该菌株产生的主要抗菌物质,且这两种抗生素存在反向交互作用。抗生素的产生往往受其合成通路上的多种基因所调控,同时也会受到一些转录因子的调控。前期研究结果表明,Vfr(Virulence factor regulator)负调控抗生素2,4-DAPG的产生,基于此,本研究通过染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)、细菌单杂交、ChIP-qPCR和凝胶电泳迁移率实验(EMSA)等方法,进一步探究转录因子Vfr对2,4-DAPG合成的调控机制。具体结果如下:首先构建了 Flag标签融合的vfr表达菌株,利用ChIP-seq技术手段富集并筛选到与Vfr结合的靶基因序列。数据分析结果表明,Vfr直接调控了 90个基因的表达,这90个基因功能可划分为17类,包括次生代谢、转录因子、双组分系统、戊糖磷酸途径、生物膜形成、细菌趋化性和运动性、分泌系统等。再利用实时定量RT-PCR检测这90个基因的表达,结果表明,7个基因的转录水平升高(>2倍),21个基因的转录水平降低(>2倍),其中,vfr基因自身转录水平降低5.5倍。并且推定了 Vfr的一致结合基序[A/G]TCACA[T/G/C][G/A/C/T]。其次,构建了 Vfr蛋白的原核表达载体。并且在大肠杆菌BL21菌株中成功表达了与His标签蛋白融合的Vfr,其中一部分是可溶性蛋白,一部分以包涵体的形式存在,分子量大小约为25 kDa,蛋白的诱导条件为IPTG终浓度0.5 mM,20℃诱导8h。利用镍柱吸附在150 mM咪唑洗脱下可以得到纯化蛋白,经过浓缩后蛋白浓度为685 ng/μL。最后,比较野生菌和缺失菌中表达量变化基因,选取与抗生素2,4-DAPG和HCN合成相关的phlF、phlG、hcnB及vfr4个基因进行深入研究,结果表明,转录因子Vfr能够直接结合vfr、phlF、phlG和hcnB基因的启动子区。综上,生防假单胞菌FD6中受Vfr直接调控的基因可达30个;转录调控因子Vfr可以进行自体调控,通过直接作用于phlF、phlG和hcnB影响这2种抗菌物质合成。