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地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)为玄参科(Scrophulariaceae)地黄属多年生草本植物,以块根入药,具有滋阴清热、补血止血等功效,是著名的“四大怀药”之一。地黄是我国的大宗药材,应用十分广泛,是很多中成药和方剂配伍要药的主要原料。药材来源依赖栽培,但目前地黄块根发育的分子机制不明,药材生产易受自然条件如病害、连作障碍等影响,造成药材产量与质量的降低,为此有必要对地黄开展分子生物学研究,探索地黄块根发育机制,指导地黄生产实践。为此,我们首先开展了地黄荧光定量PCR内参的研究,筛选出在地黄不同组织器官中表达稳定的内参基因。本实验应用BestKeeper、GeNorm和NormFinder 3种软件对地黄内参基因稳定性进行评价。基于三种软件的综合分析结果,我们发现Tip41、UCH2、rGAPDH、GAPDH四个基因在地黄不同组织器官中的表达稳定性较好,其中以TIP41最为稳定,可选择作为地黄定量表达研究的内参基因。地黄内参基因的筛选为下一步地黄块根发育相关基因的筛选奠定了基础,也为今后地黄的其它分子生物学研究提供了便利。随后,为了探索地黄块根发育的相关机制,筛选与地黄块根发育调控相关的基因。本研究采用Illumina公司高通量测序技术平台Hiseq2000对地黄七个组织器官,即:不定根(AR)、起始期块根(TAR)、膨大期块根(DTR)、成熟期块根(MR)、茎(ST)、成熟叶(L)、花(F)分别进行了转录组测序和功能分析。获得了 22万地黄unigene,并利用Nr、Nt、Interpro、SwissProt、KEGG、COG 和 GO 数据库对 unigene 进行了注释。在此基础上,我们根据每个基因的RPKM值得到地黄不同组织器官和地黄块根发育不同时期的基因表达量,利用Z-score的方法以地黄地上部分为参照,对块根发育差异表达基因进行了筛选(参数为Z-score>3.75和Ratio>2.0),筛选出8,393个unigenes在地黄块根内富集。然后根据地黄unigene的注释结果、以及GO、COG功能分类和KEGG代谢通路分析,筛选出与地黄块根发育相关的转录因子61个,涉及到的相关unigenes 111个。主要包括植物激素响应因子、细胞分裂相关蛋白、纤维素合成酶、乙烯响应转录因子、细胞核转录因子以及促分裂原活化蛋白激酶等。用相似方法(即,Z-score<-1.5和Ratio<0.5),筛选出1,048个Unigenes在地黄块根的四个不同时期中下调。然后根据基因功能注释,筛选出可能与地黄块根发育相关的转录因子26个,涉及Unigenes 29个。主要包括AUX/IAA植物激素诱导因子、C3HL家族转录因子、MADS家族转录因子和LOB家族转录因子等。通过筛选地黄块根发育相关的差异表达基因,探索块根发育的分子机制,为地黄块根发育分子机制的阐明和品种改良奠定理论基础。