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本文以中国大陆分离的人H5N1亚型高致病性禽流感病毒作为研究对象，分别筛选出针对该病毒膜蛋白和内部蛋白的寡核苷酸药物，并检测了其抗病毒活性，以期为研制新型抗流感病毒药物提供新的思路。全文包括三个部分：
一、H5N1亚型流感病毒血凝素的序列分析及其在大肠杆菌的表达与纯化。
首先，利用RT-PCR技术，扩增得到中国大陆分离的首例人H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因，然后对推导的氨基酸序列进行了生物信息学分析。抗原表位分析表明，该蛋白含有23个可能的抗原表位，其中17个抗原表位位于HA1亚单位；N-糖基化分析发现HA含有7个糖基化位点，其中5个位于HAl亚单位；对16株分离自不同年代、地区和不同宿主的H5N1亚型高致病性禽流感病毒的血凝素蛋白进行同源序列比较，发现其受体结合区保持了相对的稳定性，裂解位点邻近的氨基酸序列为PLRERRRKR，符合高致病性禽流感病毒的特征；利用同源建模的方法，分析了A/Hong Kong/156/97(H5N1)和A/Anhui/1/2005(H5N1)的HA1三级结构，发现二者具有相当大的相似性，这就为基于结构进行的核酸药物研究奠定了基础。进而将去除信号肽序列的HA1克隆至原核表达载体pQE-80L，转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达，结果发现HA1以包涵体形式表达，表达量达30％以上。将此包涵体变性裂解后过镍离子亲和柱纯化，SDS-PAGE分析蛋白纯度达90％以上；Western-blot结果显示表达的蛋白大小约为37kD，并具有良好的免疫原性。我们随后大量制备了HA1蛋白，免疫小鼠，得到了高效价的鼠源HA1多克隆抗体。
二、抗H5Nl亚型流感病毒血凝素蛋白的DNA适配子筛选及其活性鉴定。
在获得纯化的HA1蛋白的基础上，应用SELEX技术筛选针对该蛋白的DNA适配子。合成了79个碱基的单链DNA文库，其两端序列固定、中间为40个碱基的随机序列。将其与靶蛋白孵育，利用靶蛋白带His标签的特性，将蛋白-核酸复合物过镍离子亲和柱，采用含100mM咪唑的洗脱液将特异性结合的复合物洗脱下来。随后以此为模板，以生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增产物经热变性后产生的单链DNA库投入下一轮筛选。如此反复筛选11轮，将每轮筛选产物以HA结合法分析随机DNA文库的富集程度。结果显示，单链DNA库与靶蛋白的亲和性逐渐升高，到第9轮后就不再上升。将第11轮的筛选产物PCR扩增后克隆至pGEM-Teasy载体，通过蓝白斑筛选随机挑选80个克隆。从中选择25个克隆测定DNA序列，分析了其二级结构并测定了HA结合活性。发现它们分为三个不同的家族(family)，其中第Ⅲ家族的10号适配子(A10)结合活力最强。进一步比较该适配子对HA1蛋白和全病毒的亲和性，发现其对后者亲和力更强。然后，大量化学合成适配子A10和A05，在流感病毒感染的MDCK细胞上进行抗病毒活性检测。发现用75pmol或100pmol的适配子A10处理后，病毒滴度显著下降，而细胞活力增强。证明所筛选的DNA适配子可在体外有效地抑制H5N1亚型流感病毒复制。
三、靶向A型流感病毒内部基因的siRNA筛选及其活性鉴定。根据H5N1和H1N1亚型流感病毒的PB1、PA、NP和NS四个内部蛋白编码基因的同源性序列，设计了四条针对不同基因的21nt siRNA，并以A/CNIC/246/2000(H1N1)(简称“246毒株”)作为模式病毒，进行抗病毒试验。首先比较了不同细胞对246毒株的敏感性。随后选择A549作为宿主细胞，对转染条件进行了摸索。流式细胞术和荧光显微镜检测显示Hiperfect/siRNA比为3μl：5nM时、siRNA剂量为50nM时就可导致基因沉默。在此基础上，我们将这四种siRNA分别转染A549细胞，然后接种流感病毒，在不同时段检测siRNA抑制病毒的效果。结果表明，与转染对照siRNA组相比，四种siRNA转染的细胞呈现不同程度的病毒抑制。分析各组的病毒滴度、RNA拷贝数及蛋白质水平的变化，发现RNAi抑制病毒效果最好的依次是：siNP、siPB1、siNS、siPA。流式细胞术和荧光显微镜分析结果显示，针对PB1的siRNA可抑制病毒引起的细胞凋亡。进而检测了siRNA在鸡胚抑制病毒的活性。将这四种siRNA分别接种鸡胚，同时接种流感病毒。培养17hr后取鸡胚尿囊液检测发现，它们对流感病毒的抑制效果与体外实验结果一致。说明我们设计的siRNA可以有效抑制流感病毒的复制，有望应用于控制流感病毒感染。
综上所述，本研究首次筛选到针对人H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白的DNA适配子，并证明其在体外有抗病毒活性；本研究还首次报导针对流感病毒NP尾部编码基因和PB-F2编码基因所设计的siRNA，可有效地在体内外抑制流感病毒的复制或抑制病毒感染引起的细胞凋亡。这些寡核苷酸为研制新型抗流感病毒药物奠定了基础，并为研究相关基因及其编码蛋白功能提供了有利的工具。