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约10~15%育龄夫妇存在不孕不育问题,其中男性因素约占50%。男性不育的病因和发表机制复杂,至今未能完全阐明。在少弱精子症、无精子症中,超过15%与遗传变异有关。然而,人类男性不育症发病机制研究受到研究材料及伦理的限制,而且缺乏合适的实验动物模型。胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)经诱导可分化为三胚层来源的所有细胞类型,包括精子细胞、甚至形成活动的精子。体外诱导人胚胎干细胞(hESCs)向精子分化的过程,再现了体内精子发生;同理,若体外hESCs向精子分化发生异常,可提示体内精子发生障碍。目前hESCs尚未能像小鼠胚胎干细胞(mESCs)一样体外诱导分化形成形态与功能完全成熟的精子;但是,体外诱导分化hESCs,已成为研究人类精子发生、探讨生精障碍机制的理想模型细胞。本研究利用2例不育夫妇捐献的胚胎成功建立hESC系,其中1例丈夫为染色体罗氏易位携带者、伴严重少弱精子症,另1例丈夫为染色体平衡易位携带者、伴严重的少弱精子症。二株hESC系经鉴定之后,体外诱导其向精子细胞分化,分析其精子细胞特异标记基因的表达水平,初步探讨精子发生关键基因的作用及潜在的机制,也为评估少弱精子症患者辅助生殖子代的遗传风险提供实验依据。一、材料与方法1.建立胚胎干细胞系:一例染色体罗氏易位(45,XY,rob(13;14)(q10;q10))和一例染色体平衡易位(46,XY,t(1;18)(p12;q22))、均伴严重少弱精子症的患者,女方生殖系统功能正常。利用这2对夫妇在辅助生殖技术(assisted reproduction techniques,ART)治疗中捐赠的拟废弃胚胎(签署知情同意书),分离囊胚内细胞团,培养、传代、扩增,建立ESCs。2.鉴定ESCs细胞系:通过免疫荧光、拟胚状体形成、体内畸胎瘤形成和实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测hESC的多能性,基因测序检测其染色体核型。3.体外诱导向精子细胞的分化:在干细胞培养液内添加维甲酸(retinoic acid,RA)体外诱导分化,通过拟胚体(embryoid bodies,EBs)的形态、免疫荧光、RT-qPCR分析其向生殖细胞分化过程及其相关基因的表达,并与遗传背景完全正常的ESC相比较。二、结果1胚胎干细胞建系和鉴定1.1建立和鉴定CCRM16细胞株利用1例染色体罗氏异位伴严重少弱精症夫妇捐献的拟废弃胚胎,成功建立胚胎干细胞系(本实验室命名为CCRM16)。染色体G带分析表明,CCRM16细胞系的核型为46,XY,+14,rob(13;14)(q10;q10),与来源胚胎核型一致。细胞呈典型的干细胞克隆状生长,边界明显,细胞核大、核仁清楚,核质比高;表达多能性标志物OCT-4、NANOG、SSEA-4和TRA-1-81,能在体内和体外培养时形成EBs。1.2建立和鉴定CCRM27细胞株利用1例染色体平衡易位伴少弱精症夫妇捐献的拟废弃胚胎,建立胚胎干细胞系(本实验室命名为CCRM27)。染色体G带分析表明,CCRM27细胞系的核型为46,XY。与胚胎来源的一枚卵裂球的核型不一致。细胞呈典型的克隆状生长,边界明显,核大、核仁清楚,核质比高;表达多能性标志物OCT-4、NANOG、SSEA-4和TRA-1-81,能在体内和体外培养时形成EBs。2体外诱导CCRM16和CCRM27向精子细胞分化及鉴定2.1体外诱导CCRM16向生殖细胞分化以正常夫妇捐赠胚胎建立的胚胎干细胞系CCRM23(46,XY)为对照。体外培养CCRM16过程中添加2μM的RA以诱导其分化。经诱导分化的CCRM16,原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)标志基因DAZL和减数分裂标记基因SCP3、VASA的表达水平明显减少。2.2体外诱导CCRM27向生殖细胞分化以CCRM23为对照。CCRM27经2μMRA诱导分化后,PGC标志基因DAZL和减数分裂标记基因SCP3、VASA的表达水平明显减少。DAZL直接调控的靶基因STRA8,SMC1B和TEX11的表达水平在CCRM27中亦较CCRM23明显减少。在全基因组测序中,没有发现大于4M的缺失。三、结论1.本研究成功建立了2株具有严重少弱精子症特异背景的胚胎干细胞系(CCRM16和CCRM27),均具有胚胎干细胞典型特征。2.CCRM16和CCRM27呈现早期精子分化延迟。3.CCRM16、CCRM27可作为精子发生障碍的研究模型,用以研究精子发生的关键基因,进一步探讨其作用及机制。同时,这类细胞模型也可能为评估少弱精子症患者ART出生子代的遗传风险和生殖健康风险提供实验依据。