此论文中主要讨论了非天然氨基酸标记的方法和应用,FNMR的优势和在各领域中的应用。我们结合非天然氨基酸标记和I9F NMR来研究蛋白质的结构和功能,本论文共分为六个章节。第一章介绍了非天然氨基酸标记的方法及其应用。通过非天然氨基酸的引入来研究生物学过程,可以解决传统方法无法解决的一些问题。将非天然氨基酸位点特异性引入最有力的方法是通过遗传密码子扩增,该方法在需要标记的位置引入琥珀密码子(TAG)突变,筛选到能识别琥珀密码子的氨酰tRNA合成酶/tRNA对将非天然氨基酸引入,另外,可以通过化学连接方法辅助这种非天然氨基酸引入的方法。非天然氨基酸也可以通过选择压力的方法以氨基酸特异性的方式引入,这种方法会导致基因组特定氨基酸全方面的标记,而不是定点标记。本章还重点介绍了氨基酸特异性和位点特异性两种非天然氨基酸标记方法在各方面的应用以及在一些前沿科技方面的应用。第二章介绍了利用FNMR研究蛋白质的结构和功能。19F自旋量子数为1/2,自然丰度是100%,磁旋比高,没有背景信号干扰,灵敏度高,使用氟原子代替氢原子不会明显的影响分子的结构,19F核的多种特性使其成为研究生物学过程的有力工具。核磁共振能研究蛋白质的结构,功能,底物结合,构象变化等信息。本章第一部分总结了氟核应用于核磁共振的优势,接下来介绍了氟标记蛋白质和多肽的合成原理和方法,最后重点介绍了结合19F NMR和氟标记探针方法在各领域中的应用,包括研究蛋白质和核酸的结构和功能、药物的开发和筛选、代谢过程、生物活性分子体内追踪等信息。第三章描述了应用位点特异性19F标记和19FNMR研究crude lysate蛋白质间相互作用。我们成功的通过化学方法合成了非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸,并利用19FNMR分析两个促分裂原激活蛋白激酶(MAPKs):MEKK3和MEK5的PB1结构域在天然细胞环境下蛋白质间的相互作用。高度保守的MAPKs家族是一个参与信号转导的重要体系,其中比较重要的是参与从细胞膜到细胞核或细胞内其它位置的信号传递。MEKK3和MEK5在N端都含有一个PB1结构域,它们通过形成二聚体发挥作用。我们将19F-tfmF分别插入到MEKK3-PB1和MEK5-PB1的不同位点,然后通过19F NMR化学位移变化和弛豫分析MEKK3-PB1和MEK5-PB1的相互作用界面,我们还证明了MEKK3-PB1和MEK5-PB1共纯化样品结合界面标记位点的化学位移变化与在细菌浓浆样品(crude lysate)样品中的变化一致。第四章介绍利用19F固体核磁共振来研究蛋白质的磷酸化信息,以及在苯乙烯马来酸酐(styrene maleic anhydride, SMA)作用下形成的脂碟(lipodisq)对细胞膜环境的改变。我们证实了苯乙烯马来酸酐包裹形成的单层囊膜脂碟在膜蛋白相关结构和功能研究中的优势。饼状胶束(bicelles)和纳米碟(nanodiscs),虽然也可以提高底物与膜蛋白的接触几率,但或需要特殊脂质,或需要去污剂参与,或由于膜支架蛋白的影响,使其都不是最佳的研究介质。Lipodisq一方面能维持完整的细胞膜环境,另一方面还可以提高底物与膜蛋白的接触几率,为利用19F固体核磁共振方法或者其它生物物理方法研究天然细胞膜环境下配体受体结合,酶学分析,蛋白质间相互作用提供了便利。第五章主要介绍小分子荧光探针的发展以及在生物学中的应用,结合非天然氨基酸标记和小分子荧光探针L-(7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine荧光寿命等荧光特性研究蛋白质的结构和功能。第六章主要介绍了非天然氨基酸标记和19F NMR技术的展望。在细胞天然环境下研究蛋白质结构和功能更能反应其真实的生物物理信息,非天然氨基酸标记技术和核磁共振技术的发展为这些研究提供了有力的工具。