论文部分内容阅读
梅毒是严重危害人类健康的传染病之一，其病原体为梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）。血清梅毒抗体水平是诊断梅毒螺旋体感染的主要指标，传统方法包括性病实验室研究试验、荧光螺旋体吸收试验和梅毒螺旋体血球凝集试验等。近年来，以酶标板为载体的梅毒螺旋体IgM和IgG抗体的检测已被用于临床检验和血站血液筛查。本研究工作包括两个部分：1．梅毒螺旋体抗原TpN17在毕赤酵母中的表达与纯化。2．以金磁微粒为载体，利用纯化得到的TpN17抗原和市售梅毒螺旋体混合抗原（TpN15，TpN17，TpN47）建立针对梅毒螺旋体抗体的双抗原夹心检测方法。通过甲醇诱导，毕赤酵母表达系统中表达重组梅毒螺旋体抗原TpN17，样品经饱和硫酸铵沉淀粗提后，以阳离子层析交换柱对表达的TpN17进行进一步纯化。结果表明，样品经硫酸铵沉淀、PB复溶后以阳离子交换层析柱进行纯化，NaCl浓度梯度洗脱，可获得纯度大于90％的重组梅毒螺旋体抗原TpN17。Bradford法测定蛋白浓度为0.66 mg／mL。用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶（HRP）标记到抗原TpN17上，双抗原夹心法测定HRP-TpN17滴度为1：3，200，作为包被的TpN17和标记抗原HRP-TpN17可用于梅毒螺旋体抗体的检测。金磁微粒（Fe3O4／Au）是结合磁性氧化物粒子和胶体金特点的新型磁性复合微粒，组装结构的金磁微粒具有磁性Fe3O4核，表面组装有大量纳米级金粒子，集胶体金对生物分子的快速固定化和磁性纳米粒子在外磁场可分离性于一体，在免疫学检测领域具有重要的应用价值。利用双抗原夹心法原理，以纯化得到的TpN17和标记抗原HRP-TpN17，初步建立了基于金磁微粒的梅毒螺旋体抗体的检测方法。金磁微粒表面形成夹心复合物后以3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物显色，磁性分离后测定上清液在450nm处吸光度值。结果表明，在固定抗原量为480ng/管、HRP-标记抗原稀释度为1：1，600时，阳性血清的检测值可达1.7以上，对已确诊患者血清样本的检测表明，该方法的阳性检出率为93.3％，还存在6.7％的漏检率，说明方法的灵敏度和特异性还有待改进。为完善以金磁微粒为载体检测梅毒抗体的方法，采用市售的重组梅毒螺旋体混合抗原（TpN47，TpN17，TpN15）对梅毒螺旋体抗体进行检测。将固定有混合抗原的金磁微粒与血清（或血浆）及HRP-标记混合抗原在37℃温育30 min后以3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物显色，磁性分离后测定上清液在450 nm处吸光度值。对方法的临界值、重复性、灵敏度、特异性等参数进行确定。方阵滴定结果表明固定抗原量为420 ng／孔、HRP-标记抗原稀释度为1∶4，000为最佳反应条件。本方法批内变异系数（CV）值在5％以下，批间CV值为6.82％，符合免疫学载体的要求。该方法与以酶标板为载体的商品化试剂盒检测结果符合率为100％，灵敏度是商品化试剂盒的10倍。所建立基于金磁微粒的梅毒螺旋体抗体检测方法具有潜在的应用价值。