论文部分内容阅读
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪肠道疾病,以引起严重的肠炎和腹泻为主要特征,哺乳仔猪的病死率高达90%,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。本研究建立了基于TaqMan探针的PEDV实时荧光定量PCR检测方法,并应用此方法对一些临床和人工发病的样品进行了检测。1.PEDV实时荧光定量PCR检测方法的建立根据GenBank中猪流行性腹泻病毒N基因序列设计一对引物,用PCR方法从PEDV病料中扩增出N1基因(449bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,经PCR、酶切、测序鉴定,筛选出重组质粒pMD18-T/N1。根据PEDV N基因序列中的保守片段设计一对特异引物和TaqMan探针。以质粒pMD18-T/N1为模板,通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD18-T/N1为标准品进行实时荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了PEDV的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明该方法检测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为7.03、9.93、13.55、；变异系数分别为0.9%、1.1%、0.6%,均小于5%。说明此方法具有良好的准确性和重复性。对阳性模板的检测结果表明该方法的检测灵敏度高于常规PCR。2.PEDV实时荧光定量PCR检测方法的应用应用PEDV实时荧光定量PCR和常规RT-PCR共检测样品97份,其中细胞毒14份,人工感染猪病料52份,临床病料31份。实时荧光定量PCR检测到32份阳性病料,而常规RT-PCR检测到25份阳性。结果表明,实时荧光定量PCR方法灵敏度高于常规RT-PCR。证明建立的实时荧光定量PCR法具有特异、敏感等优点,在检测猪流行性腹泻病毒具有应用价值。