强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一种主要累及中轴关节的慢性结缔组织炎症性疾病。虽然AS的确切发病机制目前仍不清楚,但可以明确的是炎症是AS发病和进展的最主要病理特征。对AS发病部位活检组织的研究结果提示,巨噬细胞是AS发病部位侵润的主要细胞之一,这提示巨噬细胞在AS的炎症过程中发挥了重要作用。巨噬细胞在局部微环境的刺激下,可获得不同的表型特征并表现出不同的功能状态。其表型的动态变化与机体的病理状态相关,经典活化(Classically Activated Macrophage)又称M1型活化提示炎症的启动、进展和维持,替代活化(Alternatively Activated Macrophage)又称M2型活化提示炎症的消退、慢性炎症的形成以及组织的修复,其在M1和M2间的活化过程被称为极化现象。外核苷三磷酸盐二磷酸水解酶3(Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase 3,ENTPD3)是ENTPDase家族的成员,其主要作用是水解核苷三磷酸(Nucleoside triphosphate,NTP)和核苷二磷酸(Nucleoside diphosphate,NDP),最终产物是腺苷、核苷单磷酸(Nucleoside monophosphate,NMP)和无机磷酸。作为对代谢失调的反应,内源性腺苷释放到胞外空间后发挥了广泛的免疫调节作用,单核吞噬细胞系统是其主要的作用靶点。腺苷通过G蛋白偶联受体调节巨噬细胞的功能,从而参与炎症和组织修复进程。那么,单核巨噬细胞在AS这一炎症性疾病中的极化情况如何?ENTPD3在AS患者中是否有异常表达?其在巨噬细胞极化中的作用如何?这些问题目前仍然不够明确。本课题拟通过研究初步明确AS患者单核巨噬细胞极化的情况,以及揭示ENTPD3在AS中是否差异表达及其对单核巨噬细胞极化的调节机制,为AS治疗提供新的干预靶点。研究分为以下四部分:第一部分:标准化AS生物样本库的建立及髋关节韧带组织差异表达基因的筛选目的:建立标准化的AS生物样本库,通过AS髋关节韧带组织基因芯片技术筛查目的基因。方法:按照标准化操作流程对入选患者的术前血液、尿液和术中新鲜髋关节韧带组织标本进行收集、处理、分装、储存,对部分韧带组织行石蜡包埋保存;应用制作好的临床数据库软件及样本库管理软件,建立临床资料完整的AS生物样本库,定期对样本进行质量监测。从AS生物样本库随机抽取AS髋关节韧带组织标本3例及年龄、性别匹配的对照组髋关节韧带组织标本3例,进行基因芯片筛查,用基因功能分析(Gene Ontology Analysis,GO-Analysis)的方法对基因功能的显著性进行分析,结合生物信息学的研究方法选取差异表达的基因。结果:建立了标准化的AS生物样本库,共收集121例AS以及作为对照研究的82例患者(20例新鲜股骨颈骨折、42例股骨头坏死及20例髋臼发育不良),标本包括新鲜冰冻髋关节韧带组织、石蜡包埋韧带组织、血液、尿液,以及完整的临床资料,所有信息录入生物样本库管理软件储存。基因芯片分析共筛选出可能具有意义的差异基因697个,按照差异倍数1.5倍进行初步分析,上调1.5倍以上40个,下调1.5倍以上91个。ENTPD3显著上调(上调倍数为2.12倍,P=0.003)。结论:标准化AS生物样本库的建立为AS发病机制研究提供了理想的发病部位组织标本。髋关节韧带组织基因芯片筛查发现,与NTP及NDP分解代谢过程关系密切的ENTPD3显著上调。第二部分:ENTPD3在AS髋关节韧带组织中的差异表达验证及临床关联研究目的:验证ENTPD3及其蛋白在AS髋关节韧带中的差异表达情况,揭示其与AS炎症及结构损伤指数之间的相关性。方法:从AS生物样本库随机抽取AS髋关节韧带组织标本17例及对照组髋关节韧带组织标本(髋臼发育不良)17例,荧光实时定量聚合酶链反应方法检测ENTPD3m RNA表达水平;分别抽取5例AS及5例对照组石蜡包埋髋关节韧带组织,进行免疫组化分析,检测ENTPD3蛋白水平表达差异。收集患者的临床资料,利用相关分析进行ENTPD3与临床资料的相关性检验。结果:AS组中ENTPD3 m RNA及蛋白水平明显高于对照组(P=0.015,P<0.001);ENTPD3与反映AS患者结构损伤的改良Stoke强直性脊柱炎脊柱评分(modified Stoke Ankylosing Spondylitis Spine Score,m SASSS)正相关(r=0.639,P=0.006),与炎症指标血沉负相关(r=-0.521,P=0.032)。结论:ENTPD3在AS髋关节韧带中明显高表达,且与AS患者结构性损伤指数m SASSS正相关,与血沉负相关,提示ENTPD3可能参与了AS的炎症及韧带骨化过程。第三部分:AS患者外周血中ENTPD3与单核巨噬细胞极化的关系目的:探讨AS患者外周血中单核细胞极化情况及ENTPD3与单核巨噬细胞极化的关系,并评估其与AS炎症指标和结构损伤指数的关系。方法:分别收集年龄、性别匹配的120例AS、50例类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)及100例健康人群的外周血,用流式细胞术检测M1(CD68+CD192+)标志、M2(CX3CR1+CD163+)标志及ENTPD3的表达水平,用ELISA法检测血清肿瘤坏死因子a(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-a)及IL-10水平;收集20例接受抗TNF-a治疗AS患者治疗前的外周血及治疗后12周的外周血,重复检测上述分子;收集入选研究对象的临床信息,分析其与ENTPD3及单核巨噬细胞极化的相关性。结果:与健康对照组相比,AS患者M1比例明显降低(1.63±0.87%;P<0.001),M2比例明显升高(44.7±11.71%;P<0.001);M2/M1的比值在健康对照组、RA组及AS组中分别是7.18±6.12,2.54±3.14和35.61±20.04(P<0.001);AS中M2/M1比值与m SASSS正相关(r=0.588;P<0.001),并与ESR(r=-0.321,P<0.001)及CRP(r=-0.265,P<0.001)弱相关;ENTPD3主要在单核细胞中表达,与M2极化相关(r=0.571,P<0.001);AS患者抗TNF-a治疗后M1细胞的比例显著降低(-0.60±1.01;P=0.016),M2细胞的比例无明显变化(-1.46±15.27;P=0.675)。结论:AS患者外周血中单核细胞的极化以M2型为主,M2/M1比值不仅能反映脊柱结构损伤的情况,还在一定程度上反映炎症活动情况。ENTPD3主要在单核细胞表达并与M2极化密切相关。第四部分:体外细胞水平探讨ENTPD3对巨噬细胞极化的作用机制目的:探讨在体外细胞水平ENTPD3对巨噬细胞极化的调节机制。方法:体外培养THP-1细胞,分别以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)100 ng/m L(M1)和IL-4 10 ng/m L(M2)刺激诱导极化,应用流式细胞术检测M1(CD68+CD192+)标志、M2(CX3CR1+CD163+)标志及ENTPD3的表达水平,ELISA检测培养上清TNF-a及IL-10水平;分别转染ENTPD3 si RNA及腺病毒过表达重组体,重复检测上述指标,并以Western Blot检测NF-KB(Nuclear factor KB)、STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3)转录因子及其磷酸化水平;以相应的抑制剂对NF-KB、STAT3进行抑制,重复上述检测。结果:LPS刺激THP-1细胞24h后,CD68+CD192+明显升高,CX3CR1+CD163+降低,TNF-a明显升高,磷酸化的IKB明显升高,IKB明显降低,细胞核中NF-KBp65明显增多;ENTPD3干扰后,上述变化更为明显;ENTPD3过表达后,CD68+CD192+有所降低,CX3CR1+CD163+略有升高,TNF-a略有降低,磷酸化的IKB及细胞核中NF-KBp65有所降低,而IKB略有增多;加入NF-KB抑制剂后,可明显抑制LPS的刺激作用。IL-4刺激24h后,THP-1细胞的CX3CR1+CD163+表达明显升高,CD68+CD192+则显著降低,IL-10明显升高,STAT3和细胞核中磷酸化的STAT3明显升高,ENTPD3过表达后,上述现象更为明显,ENTPD3干扰后,CX3CR1+CD163+表达略有降低,CD68+CD192+则略有升高,IL-10水平降低,STAT3和细胞核中磷酸化的STAT3降低;加入STAT3抑制剂后,IL-4的刺激作用明显受到抑制。结论:ENTPD3通过促进STAT3通路活化、抑制NF-KB活化,从而调节巨噬细胞向M2极化。