论文部分内容阅读
家蚕是鳞翅目的模式昆虫,具有重要的经济价值,其丝腺是一种高度特异化且能够高效地合成丝蛋白的器官,研究表明丝蛋白基因的表达主要是在转录调控水平上进行的,这是目前研究的热点。锌指蛋白是一类在真核细胞中普遍存在的与细胞内核酸特异性结合的转录因子。本研究发现了在家蚕丝腺特异表达的并且含有C2H2型ZFP结构域的转录因子—BmZFP16-like,采用克隆、表达、qRT-PCR、western blot等技术对其生物信息学特征、转录水平以及蛋白质水平的组织表达模式进行了分析,探讨了BmZFP16-like在家蚕丝素重链蛋白基因的转录调控中的作用。获得的主要研究结果如下: 1、通过在GenBank中与其它鳞翅目昆虫锌指蛋白保守序列比对,设计特异性引物进行克隆、测序,序列分析表明该基因的ORF序列为984 bp,编码327个氨基酸,预测该蛋白分子量为37.4 kDa,其等电点为6.15。该蛋白质C末端含有6个高度保守的ZFP结构域,属于ZFP家族,进化分析表明该序列与黑脉金斑蝶锌指类蛋白ZFP16同源性较高,因此命名为BmZFP16-like。 2、构建了原核表达质粒pET28a-BmZFP16-like,转化至E. coli Transetta(DE3),用不同浓度 IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和 Western blot的检测结果表明BmZFP16-like融合蛋白能够在原核表达系统中高效表达。通过Ni柱亲和层析纯化了该重组蛋白,并制备了多克隆抗体。 3、分别提取家蚕丝腺等不同组织及家蚕不同发育时期丝腺的RNA和总蛋白,通过荧光定量PCR和Western blot分析家蚕BmZFP16-like在不同组织及不同发育时期的转录水平和蛋白表达情况。结果表明 BmZFP16-like基因的表达存在相对的时空特异性,其中在丝腺中的表达量最高,在脂肪体中表达量最低,从四眠后期开始逐渐升高,到五龄7天达到最高,到预蛹期基本不表达,这一表达模式与丝素重链基因(fib-H)的表达模式类似。 4、提取不同品种(P50和H9)的丝腺RNA和总蛋白,运用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测丝腺中 BmZFP16-like的转录表达水平和蛋白表达情况。结果显示BmZFP16-like基因在H9中的表达量要高于P50,由此推测BmZFP16-like基因很可能参与fib-H基因的转录调控。 5、对BmZFP16-like与fib-H的表达调控区相互作用分析,BmZFP16-like第二个锌指结构域α螺旋区的3个氨基酸可以与fib-H启动子的5’上游侧翼区TATA盒相互识别,预示着 BmZFP16-like基因可能在丝蛋白基因的转录调控网络中发挥着重要作用。