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角膜病是当今世界重要的致盲性眼病之一,国内外目前对于角膜内皮失代偿疾病导致的角膜病盲主要还是用各种类型的角膜移植手术这一比较传统的治疗方法,但是供体来源的匮乏这一世界难题一直未曾得到真正解决,所以寻找一种可以代替角膜内皮细胞的细胞或是方法,就成为角膜内皮疾病研究的焦点。本实验尝试通过骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,选用恒河猴10 只,全麻后取恒河猴自体(BMSCs:Bone marrow mesenchymal stem cells)和恒河猴角膜内皮细胞(CECs:Corneal endothelial cells),进行分离培养鉴定。按照诱导方式的不同将恒河猴BMSCs分为6个实验组,正常培养的恒河猴BMSCs及CECs为正常对照组,分别对6个实验组的恒河猴BMSCs给予不同的诱导条件进行诱导分化,并分别对诱导分化后的细胞形态学变化进行观察及检测细胞因子和标志性蛋白的表达变化,对诱导分化后的细胞和正常培养的恒河猴BMSCs之间的差异进行对比,观察哪一种诱导方式诱导分化后的恒河猴BMSCs更加接近角膜内皮细胞,实验结果表明:当恒河猴BMSCs在不同诱导条件下(在一定浓度范围内增加培养基中的房水浓度、恒河猴BMSCs与恒河猴CECs直接接触共培养、恒河猴BMSCs与CECs间接共培养、恒河猴BMSC与恒河猴(CEC-CM)接触共培养)均有向类角膜内皮样细胞方向分化的潜能;恒河猴BMSCs与自体晶体匀浆液接触共培养后向类角膜内皮样细胞方向分化的趋势不明显,恒河猴BMSCs中加入虹膜组织提取物培养后无向类角膜内皮样细胞方向分化趋势和潜能、并且虹膜组织对于恒河猴BMSCs生长、增殖有明显的抑制作用。对恒河猴BMSCs分化为CECs的可行性和影响因素进行初步分析研究。为下一步应用自体BMSCs诱导分化治疗人类角膜内皮功能失代偿疾病奠定重要的理论基础。同时本实验成功的对恒河猴CEC进行了在体外的分离培养和冻存复苏,为恒河猴CECs的体外培养、鉴定、冻存提供了成功经验。[目的]利用恒河猴骨髓间充质干细胞(BMSC)具有的多向分化潜能,拟通过将恒河猴的BMSCs与角膜内皮细胞(CECs)体外共培养,并分别加入不同配方的培养液,诱导恒河猴BMSCs向角膜内皮样细胞分化。对分化的恒河猴BMSCs和培养的CECs进行细胞形态学分析、超微结构分析、特异性表面分子和蛋白表达的检测、诱导分化过程中特定细胞因子的变化的检测。验证恒河猴BMSCs诱导分化为角膜内皮样细胞的可能性,同时对比不同诱导条件下的诱导结果。探讨影响诱导分化的因素和寻找BMSCs诱导分化的最佳条件,为下一步应用自体BMSCs诱导分化治疗人类角膜内皮功能失代偿疾病奠定一定的理论基础。[方法]本实验选用恒河猴10只,由中国医学科学院昆明医学生物研究所灵长类研究中心提供,雌雄兼有,年龄16-28个月,体重4-6.5公斤。全麻后取恒河猴自体BMSCs和CECs进行分离培养,并通过流式细胞仪检测细胞的表面标记物、和进行成骨成脂诱导分化[1]证实本实验所提取分离培养的细胞是具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)免疫组化检测和对分离提取的恒河猴角膜内皮细胞进行细胞表面特异性蛋白免疫荧光染色鉴定[2]证明本次实验所分离提取的细胞是恒河猴角膜内皮细胞。根据诱导方法的不同将恒河猴BMSCs分为6个实验组,正常培养的恒河猴BMSCs及CECs为正常对照组。对分别对6个实验组的河猴BMSCs给予不同的诱导条件,对恒河猴BMSCs进行诱导分化后,观察恒河猴BMSCs细胞形态学变化及检测诱导后的恒河猴BMSCs细胞表面特异性蛋白表达变化。探讨恒河猴BMSCs细胞分化为CECs细胞可行性和影响因素。[结果]1.成功实现了恒河猴角膜内皮细胞在体外的分离、培养和鉴定,其细胞形态非常典型;恒河猴角膜内皮细胞经多次传代(6次传代)培养和冻存复苏后生长状态良好、细胞形态典型,而且角膜内皮细胞特异性蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达阳性、细胞离子泵Na+-K+-ATP酶蛋白表达阳性、细胞紧密连接蛋白ZO-1蛋白表达阳性,证明本次实验所分离提取的细胞是恒河猴角膜内皮细胞。2.不同培养条件对恒河猴BMSCs诱导分化结果2.1不同房水浓度对恒河猴BMSCs诱导分化结果:在15%和25%两种不同房水浓度的培养液中培养的恒河猴BMSCs细胞形状有向多边形变化的趋势,排列变得松散,两组细胞分别进行NSE染色细胞内均可见粗大的棕色颗粒。ZO-1荧光染色显示:见细胞核被DAPI着染为蓝色、细胞膜和胞浆染色未见明显的绿色荧光、染色结果弱阳性,Na+-K+-ATP荧光染色显示:见细胞核被DAPI着染为蓝色、细胞膜和胞浆可见明显的红色荧光着染,染色阳性。2.2恒河猴BMSCs与CECs直接共培养诱导分化结果恒河猴BMSCs与CECs直接接触共培养后,可见长梭形恒河猴BMSCs贴壁生长、行NSE染色细胞内均可见粗大的棕色颗粒。行Z0-1荧光染色后细胞膜和胞浆轻度染为绿色,染色弱阳性,Na+-K+-ATP荧光染色后细胞膜和胞浆见红色着染,染色阳性。2.3恒河猴BMSCs/CECs间接共培养诱导分化结果恒河猴BMSCs与恒河猴CECs间接接触共培养20h,可见长梭形BMSCs贴壁生长,行NSE染色后细胞内均可见粗大的棕色颗粒见。Z0-1荧光染色:细胞膜和胞浆轻度染为绿色,染色弱阳性,Na+-K+-ATP免疫荧光染色:细胞膜和胞浆见红色着染,染色阳性。2.4晶状体上皮提取物诱导恒河猴BMSCs分化结果根据是否与晶状体上皮提取物接触诱导再分为:恒河猴BMSCs与晶状体上皮提取物非接触共培养组和BMSCs与晶状体上皮提取物直接接触共培养组。与晶状体上皮提取物非接触共培养组共培养14h可见细胞变宽、形状有向多边形方向分化的趋势,NSE染色细胞内棕色颗粒着染不明显,与空白对照CECs组比较细胞内棕色颗粒着染明显减少。ZO-1免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆染色未见明显的绿色荧光、Z0-1荧光染色结果阴性;Na+-K+-ATP酶免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆见明显的红色颗粒状荧光着染,Na+-K+-ATP酶免疫荧光染色结果阳性。恒河猴BMSCs与晶状体上皮提取物直接接触共培养组共培养14h、可见细胞变宽、排列松散、形状有向多边形方向分化的趋势,但是细胞数量较非接触共培养组细胞密度低,NSE染色细胞内棕色颗粒着染不明显,与CECs组比较细胞内棕色颗粒着染明显减少。ZO-1免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆染色未见明显的绿色荧光、Z0-1荧光染色结果阴性;Na+-K+-ATP酶免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆见明显的红色颗粒状荧光着染,Na+-K+-ATP酶免疫荧光染色结果阳性。2.5虹膜组织对于恒河猴BMSCs的诱导分化结果根据是否与虹膜组织接触诱导再分为:恒河猴BMSCs与虹膜组织非接触共培养组和BMSCs与虹膜组织接触共培养组。与虹膜组织非接触共培养:可见少量梭形BMSCs贴壁生长、细胞密度明显降低未见明显向多边形方向分化的趋势,NSE染色细胞内未见明显的棕色颗粒着染、NSE染色阴性。与虹膜组织直接接触共培养14d倒置相差显微镜拍摄:未见细胞生长、只见虹膜色素颗粒,行NSE染色只见恒河猴BMSCs细胞碎片和虹膜颗粒。恒河猴BMSCs与虹膜组织非接触共培养后Z0-1荧光染色细胞核被DAPI着染为蓝色但是细胞膜和胞浆未见明显染色,BMSC细胞与虹膜组织非接触共培养后Na+-K+-ATP荧光染色细胞膜和胞浆未见染色,荧光染色阴性。因为发现恒河猴BMSCs与虹膜直接触共培养后恒河猴BMSCs的生长明显受到抑制,未见存活细胞所以无法进行免疫荧光染色检查。2.6 恒河猴BMSCs与角膜内皮细胞条件培养基(CEC-CM:Corneal endothelial c ells Conditioned medium)接触共培养:恒河猴BMSCs与角膜内皮细胞条件培养基(CEC-CM)接触共培养后细胞形状变宽、排列变疏松,细胞外形有向多边形分化的趋向,NSE免疫组化染色细胞内可见粗大的棕色颗粒、NSE免疫组化染色结果阳性。Z0-1蛋白免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆轻度着染为绿色荧光、染色弱阳性,Na+-K+-ATP酶蛋白免疫荧光染色显示:细胞膜和胞浆见明显的红色荧光着染、染色阳性。[结论]恒河猴角膜内皮细胞能成功实现在体外的分离培养冻存,改进的揭膜联合蛋白酶消化法是一种可重复性高、可靠性强的CECs提取方法,并能够显著提高恒河猴CEC细胞培养和冻存复苏的成功率,为恒河猴CECs的体外培养、鉴定、冻存提供了成功的实验经验。在一定浓度范围内增加培养基中的房水浓度有利于BMSCs在向类角膜内皮样细胞方向分化;恒河猴BMSCs与CECs直接接触共培养后恒河猴BMSCs表现出向类角膜内皮样细胞分化的趋势和潜能;恒河猴B MSCs与CECs间接共培养后BMSCs有向类角膜内皮样细胞方向分化的潜能;恒河猴BMSCs与(CECs-CM)接触共培养后均有向类角膜内皮样细胞方向分化的趋势和潜能;BMSCs与晶体匀浆液共培养后向类角膜内皮样细胞方向分化的趋势不明显。恒河猴BMSCs培养基中加入虹膜提取物培养后,恒河猴BMSCs没有向类角膜内皮样细胞方向分化趋势和潜能,并且恒河猴BMSCs的生长增殖明显受到抑制。