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新孢子虫病(Neosporiasis)和弓形虫病(Toxoplasmosis)分别是由犬新孢子虫(Neospora caninum)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)寄生于多种哺乳动物有核细胞内的一种繁殖障碍性寄生虫病,可导致妊娠母畜空怀、流产、死胎、畸胎等,新生仔畜发育缓慢等。目前还没有用于防治该类原虫病的有效疫苗和特效药物,因此建立特异、灵敏、快捷、准确的检测方法,对该类疾病的早期诊断、流行病学监测、患畜淘汰和筛选治疗药物等综合防控措施将具有十分重要的生产意义。(1)本试验以犬新孢子虫Nc2基因保守序列设计特异性检测引物和TaqMan-MGB探针建立新孢子虫病TaqMan-MGB定量荧光PCR检测方法。结果表明,Ct值与梯度稀释的阳性质粒扩增呈良好的线性关系;检测牛源性弓形虫、环形泰勒虫和巴贝斯虫等虫种新疆株阳性DNA均为阴性;经3D数字PCR扩增判定,定量荧光PCR方法的最低有效检测量为6.41拷贝/μL,灵敏性是常规PCR的1000倍;重复性试验的组内平均变异系数为1.108%,组间为2.732%;本方法与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499-2013)的检测符合率为100%(46/46)。(2)本试验根据弓形虫GRA7基因保守序列设计特异性检测引物和TaqMan-MGB探针建立弓形虫病TaqMan-MGB定量荧光PCR检测方法。结果显示,定量荧光PCR方法可特异地检测弓形虫阳性DNA,检测牛源性新孢子虫、巴贝斯虫和马驽巴贝斯虫等虫种新疆株阳性DNA均为阴性;经3D数字PCR扩增判定,其最低有效检测量为4.58拷贝/μL;组内、组间变异系数均小于5%。(3)本试验根据新孢子虫Nc2基因保守序列设计特异性检测引物建立新孢子虫病二温式PCR检测方法。引物未扩增出弓形虫等虫种阳性DNA片段;其最低有效检测量为32.5 fg/μL,循环时间较三步法PCR缩短了38 min;牛源性新孢子虫阳性检出率为10.90%(17/156),与《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T 3499-2013)的检测符合率为83.33%(30/36),差异不显著(P>0.05)。