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目的探讨不同时间针刺对Barb/c小鼠自发活动近似昼夜节律的时相特征改变及SCN全蛋白磷酸化的机制方法将108只雄性Barb/c小鼠按六个时间点分为6组,即CT0组、CT4组、CT8组、CT12组、CT16组、CT20组。每组内又分为电针组、假穴组、空白组。每只小鼠单独放置在节律室的隔离单元格内进行驯化,运用电脑进行自动光-暗控制LD 12:12,驯养10天后小鼠的自发活动节律与光暗周期同步,将光照转为恒定黑暗。(1)实验一:小鼠进入自由运行10天后,进行导引实验,电针组在相应时间电针小鼠百会、长强穴,为了电流局限在穴位,两穴位近旁各浅刺一针,以刺入皮下为度。电流频率2/15 Hz、疏密波,电流0.5 mA,每次15 min;假穴组在小鼠右侧胁肋下非经非穴处(右侧腋中线与髂嵴上10 mm做一横线的交点)电针刺激,在假穴旁再浅刺一针,电针刺激参数同电针组;空白组不予针刺及捆绑,暗置处理。每只小鼠处理完后,继续放回隔离单元格内饲养,所有动物的自发活动数据全程通过ClockLab采集分析软件记录。分析动物自发转轮活动数据,计算每日小鼠活动的峰相位、活动量、起止活动时间等。观察不同处理方式后小鼠自发活动近似昼夜节律的时相特征改变。(2)实验二:导引刺激后小鼠继续暗置,10天后进行第二次实验处理,每组小鼠实验处理同实验一,在每只小鼠针刺时间对应的2小时后,取出含SCN的脑组织,采集108个样本后,送样检测;应用TMT标记磷酸化修饰组(IMAC富集)学分析SCN全蛋白的磷酸化修饰水平,明确不同时间针刺调整昼夜节律的SCN核蛋白质磷酸化的机制。结果(1)电针能调整小鼠自发活动节律的起始活动时间,表现为CT4、CT8电针,电针组起始活动时间超前,电针组起始活动时间与假穴组相比P<0.05,与空白组相比P<0.05,有统计学意义。CT16电针组起始活动时间迟后,电针组与假穴组相比P<0.05,与空白组相比P<0.05,有统计学意义;其余时间点电针后起始活动时间转移变化无统计学意义。(2)通过不同时间点的蛋白磷酸化修饰差异水平聚类分析,在CT8、CT16的聚类趋势有特征性变化,Cluster1、Cluster2中CT8均为折线图的最低点,CT16为折线图的最高点。(3)以1.2倍为变化阈值,取两次重复实验中共同上调和共同下调的差异位点,本研究一共鉴定到位于3078个蛋白上的11232个磷酸化位点,其中2651个蛋白的7633个位点包含定量信息。以定位概率>0.75的标准进行过滤后,一共鉴定到2829个蛋白上的7605个磷酸化位点,其中2488个蛋白的6192个位点包含定量信息。(4)通过信号通路的富集分析可知,CT8时间点电针组/空白组差异修饰位点对应蛋白富集的信号通路有25条,显著性富集的有5条,CT8时间点电针组/假穴组差异修饰位点对应蛋白富集的信号通路有46条,显著性富集的通路有11条。CT16时间点电针组/空白组差异修饰位点对应蛋白富集的信号通路有41条,显著性富集的有10条,CT16时间点,电针组/假穴组差异修饰位点对应蛋白富集的信号通路有17条,显著性富集的有1条。结论(1)电针能调整Barb/c小鼠自发活动节律的起始活动时间,具有明显的依时相性,表现为CT4、CT8电针,起始活动时间超前,CT16电针后起始活动时间迟后。(2)从蛋白修饰水平分析,CT8针刺调整自发活动相位超前,可能与GABA能突触信号通路中的GABAB受体、Gi/o蛋白磷酸化修饰水平下调有关。CT16针刺自发活动相位迟后,可能与胰岛素信号通路中,AC蛋白修饰水平上调,抑制胰岛素分泌有关。