成年大鼠全脑严重缺血诱导的神经元死亡机制及3-甲基腺嘌呤的作用研究背景目前,心脑血管病位居我国死亡原因的第一位。脑组织对缺血缺氧的敏感性高、耐受性低,损伤往往最为严重,且决定着患者的预后。有研究发现自噬参与脑缺血缺氧损伤,迄今,成年动物全脑缺血复灌损伤中3-MA是否同样具有脑保护作用尚不明确。研究目的本研究旨在探讨成年大鼠20 min全脑严重缺血诱导的海马CA1区神经元死亡方式及其死亡机制,在此基础上进一步探索3-MA对全脑缺血后海马CA1区神经元死亡的作用,并阐明其作用机制。研究方法1全脑缺血模型制作：采用四血管法制作成年大鼠全脑缺血模型,缺血20 min后恢复脑血流灌注。2实验分组：①模型组(control):全脑缺血20 min；②假手术组(sham):除不夹闭双侧颈总动脉外其他同模型组；③R60组：复灌后60 min侧脑室注射600nmol 3-MA;④I30组：缺血前30 min侧脑室注射600 nmol 3-MA;⑤I60组：缺血前60 min侧脑室注射600 nmol 3-MA。3 HE染色：经左心室灌注固定、取脑石蜡包埋、制作海马冠状切片、常规HE染色,光镜下计数海马CA1区每min存活神经元数量。4免疫组化染色：海马平面冠状切片,依次经过脱腊、热修复抗原、H2O2孵育、封闭、cathepsin B或cleaved caspase-3一抗孵育、二抗孵育、3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)显色、复染、透明、封片等步骤,光学显微镜下观察。5 TUNEL染色：海马切片,依次经过脱蜡、水化、Proteinase K处理、TUNEL反应混合液反应、converter-POD反应、DAB显色、复染、脱水、透明、封片等,最后光学显微镜观察。6电镜：海马CA1和齿状回(dentate gyrus, DG)组织依次经过戊二醛固定、锇酸固定、脱水、包埋、固化、超薄切片、3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色,透射电镜观察神经元形态学改变。7 Western blot:大鼠在缺血20 min复灌不同时间点断头取脑,快速分离海马,匀浆并离心后提取蛋白,蛋白定量后进行Western blot检测。实验结果1 HE染色结果表明20 min全脑缺血诱导的神经元死亡仍以海马CA1区为主,呈现出迟发性死亡过程,复灌7天后CA1区95.2%神经元死亡。2复灌72小时(hour, h)后绝大部分CA1区变性神经元TUNEL染色阳性,表明DNA有规律地断裂,提示海马CA1区神经元死亡为程序性死亡。3电镜下观察到细胞器空泡变性、细胞膜、核膜溶解消失、核碎裂、胶质细胞增生等形态学改变,符合坏死的形态学特征。同时可观察到自噬小体和自噬溶酶体的形成,但未观察到凋亡结构,这些形态学改变符合程序性坏死。4 Western blot及免疫组化研究结果均提示全脑缺血20 min复灌后海马CA1区神经元无caspase-3表达的增加和激活,说明caspase-3依赖的凋亡不参与海马CA1区神经元程序性坏死。5 Western blot结果发现缺血20 min复灌1-48 h LC3-Ⅱ表达增加,提示复灌阶段自噬激活。6海马组织中cathepsin B主要以活化形式储存于溶酶体内,全脑缺血复灌损伤时cathepsin B的表达和激活均未出现明显改变。但复灌48 h后可见cathepsin B从溶酶体内释放到细胞质和细胞核中,且与神经元变性死亡密切相关,说明cathepsin B的释放可能是神经元死亡的决定性因素。7缺血前侧脑室注射600 nmol 3-MA能显著抑制神经元死亡,且具有时间依赖性,缺血前60 min较缺血前30 min给药更为有效,而复灌后60 min注射3-MA无保护作用。8 TUNEL染色表明缺血前侧脑室注射600 nmol 3-MA能显著减少TUNEL阳性神经元数量。9缺血前、后侧脑室注射600 nM 3-MA对cathepsin B的表达以及激活均无影响,但缺血前侧脑室注射600 nM 3-MA能显著抑制cathepsin B的释放。结论1成年大鼠全脑缺血20 min后海马CA1区神经元死亡主要是由溶酶体酶cathepsin B释放所介导的一种程序性坏死。2 3-MA对缺血诱导的神经元程序性坏死具有时间依赖性的保护作用,抑制cathepsin B的释放可能是其主要的作用机制。3本研究最大发现在于阐明了常用的自噬阻断剂3-MA另一条重要的保护途径,即抑制程序性坏死的发生,这提示某些自噬阻断剂并非完全通过自噬信号通路起作用,因此在进行自噬研究时对某些实验结果的解释需要慎重。