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近年来,无浆体和泰勒虫已成为全球范围内危害人和动物健康的重要蜱传性病原,引起人和动物感染的临床症状极为类似高热、贫血和结膜黄染等,严重感染时可导致死亡。目前已报道的无浆体种类有7种、泰勒虫有6种;临床样品检查时,常见两类病原混合感染。目前用于检查两类病原的分子生物学方法主要是巢式PCR和实时荧光定量PCR,但仅限于从种的水平针对某种特定病原的检查,对批量样品未知病原的检查耗费人力物力。本研究从属的水平成功建立了具有较高特异、敏感和重复的能够同时鉴别无浆体和泰勒虫的双重PCR方法。该方法能够从属的水平对临床样品进行初筛,然后进行种特异性鉴定,省时省力,节约成本,为无浆体病和泰勒虫病流行病学研究及病原的初步鉴定提供了技术支持。应用所建双重PCR方法对329份犬、羊和牛血液样品无浆体和泰勒虫感染情况进行了调查,并对具有重要公共卫生学意义的人兽共患病病原嗜吞噬细胞无浆体（AP）进行了种系发育分析,为我国对AP的分子流行病学和群体遗传的研究奠定了基础。AP属严格专性细胞内寄生的较小的革兰氏阴性菌,通常在宿主动物嗜中性细胞内繁殖,通过媒介蜱传播。不同细胞系对无浆体的分离培养,突破了间接研究和分子生物学方法研究该菌的局限。尽管AP作为一种重要的模式病原体,但其感染宿主及胞内存活机制有待深入研究,AP在细胞内的增殖规律尚未见报道。本研究基于AP的16S rRNA基因成功建立了更特异、灵敏和快速的检测AP的实时荧光定量PCR方法,为AP的定性、定量检测及其早期感染的快速诊断提供了技术方法。成功在HL60细胞培养羊源AP;并用所建实时荧光定量PCR方法监测AP感染HL60细胞后的动态变化,初步探明了HL60细胞培养中AP定量变化规律,为无浆体繁殖规律和致病性研究等奠定基础。1无浆体和泰勒虫双重PCR检测方法的建立及AP种系发育分析为了对批量样品未知病原进行初步筛查,本研究针对无浆体16S rRNA和泰勒虫18S rRNA基因保守区域,利用Primer5.0软件设计了其属特异性引物AR1/AF1和Tr/Tf,并通过条件优化,特异性、灵敏性和重复性试验,利用所建单PCR、双PCR方法和文献上报道PCR方法对2015年采自贵州某羊场的50份山羊血液样品进行检测确定了该方法的有效性。结果显示,本研究从属的水平成功建立了具有较好特异性、敏感性和重复性且能够区别无浆体和泰勒虫的双重PCR方法。结果表明,本研究建立的双重PCR方法可为临床样品中无浆体和泰勒虫感染的初步筛查提供技术支持。为了对临床样品中无浆体和泰勒虫进行初步筛查,进一步了解AP的感染情况,应用所建无浆体和泰勒虫双重PCR方法对243份犬血样、51份羊血样及35份牛血样进行了无浆体和泰勒虫感染情况调查,进一步用种特异性引物进行种类鉴定。结果显示,犬无浆体阳性率为13.6%（33/243）,AP阳性率为1.64%（4/243）,未检出泰勒虫感染;羊血样中两种病原混合感染率为88.2%（45/51）,其中无浆体总阳性率92.2%（47/51）,AP阳性率为80.4%（41/51）,泰勒虫总阳性率为88.2%（45/51）;牛血液样品中无浆体感染的总阳性率25.7%（9/35）,泰勒虫总阳性率22.9%（8/35）。结果表明羊血液样品混合感染无浆体和泰勒虫的情况比较普遍。为了了解AP在不同宿主源之间的种系发育,进而了解其遗传变异特点,从而为AP的群体遗传分析及其分子流行病学研究奠定基础。本研究基于AP 16S rRNA基因种对获得的犬源AP序列进行比对和进化分析,为AP在犬-人-家畜的潜在传播风险的研究奠定基础。本文获得犬源的AP阳性分离株（KX236049-KX236052）和本地区的羊源AP分离株（KU321305和KU321306）在进化树上位于同一进化分支,亲缘关系比较近。其中一株流浪犬分离株（KX236049）与美国一株人源分离株（NR044726）及本地区的一株羊源分离株KX321305序列相似性分别高达99%和100%。结果表明本研究获得的犬源AP分离株存在潜在的人兽共患风险。对采自河南某牛场的发病牛群血液姬姆萨染色镜检和PCR检查,并对牛体表寄生的蜱虫进行种类鉴定和携带病原的鉴定,结果在显微镜下观察到牛血涂片中的边缘无浆体（A.marginale）和环形泰勒虫（T.annulata）;同时PCR检测到了两种病原体DNA。确定寄生在牛体表的硬蜱为微小牛蜱（R.microplus）,且携带A.marginale（登录号KX904527）和牛源A.marginale（登录号KX840009）相似性为100%,且两条序列位于进化树的同一进化分支上;结果表明,本地区牛感染的边缘无浆体是由寄生在其体表的微小牛蜱传播引起的。2 AP实时荧光定量PCR检测方法的建立及AP在HL60细胞内的增殖规律为建立一种快捷、特异、敏感和定量检测AP的方法,本研究基于AP 16S rRNA基因的保守区设计实时荧光定量PCR的引物1-25 F/183-205R。以该引物和已知引物EE1/EE2进行巢式PCR扩增出目的片段,利用该片段构建重组质粒,进而构建了标准曲线。以设计的引物为实时荧光定量PCR引物,以重组质粒为模板,并通过特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果显示,质粒模板拷贝数在6.4×1036.4×108 copies/μL范围内显示出良好的线性关系,R2=0.99,E=1.01,斜率为=-3.30;所建方法能特异地检出AP,对常见的血液病原和ddH2O均无交叉反应;可检测到标准质粒DNA为6.4×102 copies/μL,其敏感性是常规PCR的100倍;且批内及批间变异系数为0.0-0.02%;利用该方法对30份羊血液样品检出率比巢式PCR高16.67%。且该方法可应用于AP感染的病原定性检测,也为其定量检查及早期感染的快速诊断奠定了基础。本研究成功在HL60细胞培养羊血源AP,并用姬姆萨染色镜检、巢式PCR检查、定量PCR检查和IFA等验证AP感染HL60细胞,结果显示:在感染的第5天（DPI 5）,HL60细胞内可见明显的紫红色病原体;巢式PCR检测并测序检查到HL60细胞内的AP感染;IFA试验中,接种AP的HL60细胞胞质中有免疫荧光出现,未接种AP的HL60细胞无荧光信号。应用所建实时荧光定量PCR方法监测了AP感染HL60细胞后的动态变化,结果表明,DPI 5 AP 16S rRNA含量急剧下降,之后含量急剧上升期,在DPI 13达峰值,之后AP浓度又下降,至DPI 28趋于稳定状态。本研究初步探明了HL60细胞培养中AP定量变化规律,为无浆体繁殖规律和致病性研究等奠定基础。本研究基于细胞培养获得AP 16S rRNA基因羊源分离株的序列比对和进化分析,结果显示,AP分离株（MH119059）与欧洲美洲犬源分离株（JX173651、U10873、CP006618和JX173652）和人源分离株（AF093788和NR-044762）相似性均为99.3%,且位于同一个进化分支上,与来源于中国的羊源分离株（KU321301）、两株鼠源分离株（GQ413337和KC470064）也在同一进化分支上,属于Custer 1。结果表明AP分离株具有一定的人兽共患风险。