【摘 要】
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目的:观察高龄肾气虚型不孕症行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的患者卵巢颗粒细胞中DRP1、FUNDC1、LC3B的变化,探讨补肾中药二至天癸颗粒对高龄肾气虚型不孕症行IVF-ET的患者在线粒体动力学（线粒体分裂）与线粒体自噬角度可能发生的调控机制及对临床结局的影响。方法:收集山东中医药大学附属医院生殖与遗传中心行辅助生殖技术的高龄肾气虚型不孕症患者66例,按照随机数字表法分为中药治疗组（二至天
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目的:观察高龄肾气虚型不孕症行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的患者卵巢颗粒细胞中DRP1、FUNDC1、LC3B的变化,探讨补肾中药二至天癸颗粒对高龄肾气虚型不孕症行IVF-ET的患者在线粒体动力学（线粒体分裂）与线粒体自噬角度可能发生的调控机制及对临床结局的影响。方法:收集山东中医药大学附属医院生殖与遗传中心行辅助生殖技术的高龄肾气虚型不孕症患者66例,按照随机数字表法分为中药治疗组（二至天癸颗粒+IVF/ICSI）和安慰剂组（安慰剂颗粒+IVF/ICSI）各33例,另选取正常对照组（安慰剂颗粒+IVF/ICSI）33例均为因男方因素行辅助生殖技术且女方年龄小于35岁。三组患者均采用拮抗剂方案（Gn RH-ant方案）。观察高龄两组患者肾气虚证候积分变化,比较三组患者获卵数、2PN受精数、2PN受精率、可用胚胎数、优质胚胎率、每取卵周期临床妊娠率的差异。取卵日收集各组患者优势卵泡的卵泡液并提取颗粒细胞,采用实时定量荧光PCR（Quantitative Real-time PCR）技术检测颗粒细胞中DRP1、FUNDC1、LC3B m RNA含量的相对表达;蛋白质印记（Western-blot）法测定颗粒细胞中DRP1、FUNDC1、LC3B蛋白含量的相对表达。结果:1.中药治疗组治疗前后肾气虚症状明显改善,差异显著（P＜0.01）;中药治疗组与安慰剂组相比,肾气虚症状得到明显改善,治疗前后肾气虚证候积分差值差异显著（P＜0.01）。2.获卵数比较,正常对照组均明显高于高龄两组,差异显著（P＜0.01）;中药治疗组和安慰剂组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,但获卵数呈增多趋势。3.2PN受精率比较,中药治疗组高于安慰剂组,差异有统计学意义（P＜0.05）;正常对照组明显高于安慰剂组,差异显著（P＜0.01）。4.优胚率比较,正常对照组高于安慰剂组,差异有统计学意义（P＜0.05）;中药治疗组与安慰剂组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,但优胚率呈上升趋势。5.每取卵周期临床妊娠率比较,正常对照组高于安慰剂组,差异有统计学意义（P＜0.05）;中药治疗组与安慰剂组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,但临床妊娠率呈升高趋势。6.RT-PCR结果显示:高龄两组患者较正常对照组比较,卵巢颗粒细胞DRP1、FUNDC1、LC3B m RNA的相对表达均呈现升高趋势;高龄两组比较,中药治疗后三者相对表达均低于安慰剂组,差异有统计学意义（P＜0.05）。在DRP1 m RNA的相对表达中,安慰剂组高于正常对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;在FUNDC1m RNA的相对表达中,中药治疗组高于正常对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,安慰剂组明显高于正常对照组,差异显著（P＜0.01）;在LC3B m RNA的相对表达中,安慰剂组明显高于正常对照组,差异显著（P＜0.01）。7.Western-blot结果显示:高龄两组患者较正常对照组比较,卵巢颗粒细胞DRP1、FUNDC1、LC3B蛋白的相对表达均呈升高趋势;高龄两组比较,中药治疗后FUNDC1、LC3B相对表达均低于安慰剂组,差异有统计学意义（P＜0.05）。在DRP1蛋白的相对表达中,高龄两组均高于正常对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）,中药治疗组较安慰剂组比较差异无统计学意义,但呈降低趋势;在FUNDC1蛋白的相对表达中,安慰剂组明显高于正常对照组,差异显著（P＜0.01）;在LC3B蛋白的相对表达中,中药治疗组高于正常对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,安慰剂组明显高于正常对照组,差异显著（P＜0.01）。结论:1.在高龄肾气虚型不孕女性的IVF-ET治疗周期中,应用补肾中药二至天癸颗粒能够明显改善肾气虚症状,提高2PN精率,改善优质胚胎率和临床妊娠率。2.高龄女性卵巢颗粒细胞线粒体裂变水平及自噬水平均增高,运用中药治疗后两者水平又呈现一定程度的下降趋势,甚至接近正常对照水平。二至天癸颗粒可能是通过调控卵巢颗粒细胞线粒体分裂和自噬路径中关键因子Drp1、FUNDC1、LC3B蛋白的表达,改善高龄女性卵巢颗粒细胞线粒体过度分裂和过度自噬的状态,维持线粒体形态和功能的稳定,促进颗粒细胞和卵母细胞正常发育,提高正常受精率和胚胎质量,最终提高受孕率。3.根据三种表达因子在相同组别中相对一致的表达变化及线粒体分裂与自噬的关系,我们推测DRP1介导的线粒体裂变引起了自噬的后续改变,同样的,中药对线粒体的调控作用可能是通过DRP1介导的线粒体分裂/FUNDC1介导的线粒体自噬这一条完整接续的路径来实现的。
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