前列腺癌多发生远离尿道的周边区，出现排尿困难的主动就诊者多为失去根治机会的晚期病例，或已经发生了骨肺转移。1989年起，美国应用血清PSA进行全国性的前列腺癌筛查以来，实现了前列腺癌的早期发现与早期治疗。1996年的美国资料表明，前列腺癌发病率已居男性恶性肿瘤首位，死亡率仅次于肺癌位居第二。传统的看法认为，中国是前列腺癌的极低发国家，但是，近20年来我国随着人口老龄化，生活方式与饮食结构的改变。临床前列腺癌的发病率呈逐年增长的趋势，并且，中晚期前列腺癌病例超过72% 。本论文是在“前列腺疾病防治研究中心”完成。“中心”应用血清PSA对长春市15 000余名50岁以上男性进行了前列腺癌集团筛查，前列腺癌发现率为1.7%，其中，中晚期前列腺癌占42%，早期前列腺癌接受了根治手术者只占13.1%。可见，前列腺癌也是威胁我国老年男性健康的严重疾病之一。前列腺癌治疗存在很多难题。除早期前列腺癌可获得根治性治疗的机会以外，多选用内分泌治疗，如去势或药物阻断雄激素作用等治疗方式。内分泌治疗后可取得立竿见影的效果，<WP=101>然而，2-3年后常转变为无法控制的激素非依赖性前列腺癌。后者已经成为国际性难题。因此，探索有应用前景的抗肿瘤药物与生物治疗技术具有重要意义。研究发现，信号转导子与转录激活子（STAT3 ）的过度激活及表达可导致细胞的无限生长,抵抗凋亡,发生癌变.目前,已在许多种恶性肿瘤中发现有STAT3基因的过度表达.因此将STAT3作为肿瘤治疗的靶点有可能给肿瘤治疗带来新的希望。 RNA干扰(RNAi)是一种转录后的基因沉默.它能触发某种转录后监控程序,导致特定mRNA单链的降解。其作用的主要机制为dsRNA经核酸酶降解成为21-23nt的小片段,并以其为模板,特定位点,特定间隔降解与之序列相应的mRNA. 目前已成功用于基因功能和信号传递系统上下游分子相互关系的研究,有可能为肿瘤治疗提供新策略. 并有可能为功能基因组学,基因治疗学等众多领域带来新的突破.本论文选择在恶性肿瘤高表达的信号转导子与转录激活子-STAT3（signal transducers and activators of transcription）为靶基因。应用RNA干涉（RNAi）技术沉默STAT3以观察抗前列腺癌的作用，并对其作用机制进行了初步探讨。方法1．重组pSilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒的构建与鉴定根据GeneBank(access number NM 31500)人STAT3基因mRNA的已知序列, 寻找符合特征的靶序列，合成分别针对其编码区（1570-1589,436-454，2143-2162，）位碱基序列的两条DNA寡核苷酸链（分别命名为STAT3 -1,-2,-3，其对应的蛋白结构分别位于SH2、CCD及TAD功能区）,并用RNA structure 3.7软件对其二级结构预测,每条正义链包括5＇末端APAI酶切位点和反向的两个一致的<WP=102>靶序列（19bp）,两个靶序列之间被9个非同源序列（TTCAAGAGA）所间隔．3＇末端加有TTTTTT以及EcoRI酶切位点。合成的两条互补寡核苷酸链在退火缓冲液（100mmol/L醋酸钾， pH7.4 30mmol/LHEPES-KOH，2mmol/L醋酸镁）作用下退火（900C 1 min,370C 18h）,形成双链结构,将其与Psilencer1.0-u6 分别用APAI和EcoRI限制性内切酶线性化，在T4 DNA连接酶的作用下,于160C连接反应过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，进行氨苄青霉素抗性筛选，取阳性菌落扩大培养，快速制备少量质粒，通过酶切反应鉴定重组质粒。2．重组pSilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒转染真核细胞2．1 PC3 与LNCaP细胞的转染 ：分别取1×106个PC3和LNCaP接种于100ml培养瓶中，IMDI 培养基 加入10%小牛血清，培养至80%-90%细胞融合，无血清培养基洗3遍。PC3 与LNCaP细胞各分为三组：重组质粒转染组，空质粒对照组及脂质体对照组。将经预处理的重组pSilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒与脂质体的混合物，与无血清培养基混合，再放置10min后加入上述PC3和LNCaP细胞的培养瓶中。370C, 5%CO2培养24h后，弃上清，加入10%培养基继续培养48h，收获细胞。2.2 B16细胞的转染：取1×106个B16细胞接种于100ml培养瓶中，用DMEM培养基加入10%小牛血清，培养至80%-90%细胞融合。分组及重组pSilencer1.0-U6-siRNA-stat3质粒的转染方法同上。3 MTT比色法测定细胞增殖活性PC3与LNCaP细胞用含10%小牛血清的IMDM ,37℃，5% CO2培养，长至80%汇合时，调制细胞浓度为2×105/ml接种于96孔平底培养板，每孔100 μl(2×104/孔)。将其分为<WP=103>三组,分别为空质粒对照,脂质体对照及psilencer1.0-U6-stat3-siRNA试验组.培养至68h后,在相差显微镜下观察拍照后，各孔加入浓度为5 g/L MTT20μl，温箱孵育4 h，再加入100 μl的DMSO，微振器上振荡10 min，在酶联检测仪上测波长570 nm光的吸光度(A)值。按公式抑制率%=(对照组A均值-实验组A均值)/对照组A均值×100%计算各组抑制率，抑制率＞30%即对该药敏感性高。细胞存活率%=实验组A均值/对照组A均值×100%。实验重复三次。4 流式细胞技术检测凋亡峰 用pSilenceru6-1.0- siRNA-stat3重组质粒转染PC3细胞72h后收集106个细胞，离心，用冷PBS清洗细胞2遍后，将细胞用1ml注射器快速推入70%冷乙醇中，40C固定12h以上。PBS洗2遍后，调整细胞浓度为1