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无乳链球菌属于兰氏分群中的B群链球菌，可引起多种动物和人类的感染，是奶牛隐性乳腺炎最常见的病原菌之一，给奶牛业造成了巨大的经济损失。本研究通过采集华东地区奶牛隐性乳腺炎奶样，分离、鉴定了其中的接触性病原菌无乳链球菌和金黄色葡萄球菌，分析了无乳链球菌的耐药性、鉴定了无乳链球菌的耐药基因、毒力基因等分子特征，并利用无乳链球菌菌株进行了多位点序列分型和脉冲场电泳分型技术分别构建了系统发生树，确定了菌株间的关系。在此基础上，评价了牛源无乳链球菌2b型菌毛骨架蛋白的免疫保护效力。研究成果对该地区奶牛乳腺炎的防治有参考价值。 1、华东地区奶牛隐性乳腺炎主要病原菌的分离鉴定 为了解华东地区奶牛隐性乳腺炎的接触传染性病原菌无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的流行情况，本研究从江苏、安徽、山东、浙江、江西、福建六省和直辖市上海的33个奶牛场采集了619头隐性乳腺炎患牛的奶样，对其中的无乳链球菌和金黄色葡萄球菌进行了分离、鉴定。结果显示:21个奶牛场的102头牛的奶样中分离到无乳链球菌，有6个牛场的22头牛的奶样中分离到金黄色葡萄球菌，提示这两种细菌是引起奶牛隐性乳腺炎的主要病原。 2、华东地区牛源无乳链球菌的耐药性分析 目前控制奶牛乳腺炎主要依赖抗生素。本研究检测了八种常见药品对102株牛源无乳链球菌临床分离株的敏感性。结果显示:99％的菌株对四环素耐药、63％的菌株对林可霉素耐药，61％的菌株对红霉素耐药，52％的菌株对庆大霉素耐药，并形成了19种耐药谱型，3重耐药谱最广泛，占试验菌株的40.2％，且有7重耐药菌株出现。但是有94％的菌株对青霉素G敏感，97％的菌株对头孢噻肟敏感。该结果对该地区防治奶牛无乳链球菌乳腺炎具有指导意义。 3、华东地区牛源无乳链球菌毒力基因型的鉴定 选择荚膜多糖合成酶基因、α相关蛋白基因、β蛋白编码基因bac、β-溶血素结构基因cylE、菌毛骨架蛋白基因spb、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapC、C5a肽酶基因scpB等为检测对象，用PCR方法对华东地区102株牛源无乳链球菌临床分离株的毒力基因进行了鉴定。结果显示:试验的菌株都含有cylE基因和spb2基因（编码2b型菌毛骨架蛋白），但都缺乏bac和scpB基因;89％的菌株荚膜多糖Ⅰa型合成酶基因检测阳性，11％的菌株荚膜多糖Ⅱ型合成酶基因检测阳性;93％的菌株α相关蛋白基因检测阴性，5％的菌株alp1基因检测阳性，2％的菌株alp4基因检测阳性。 4、华东地区牛源无乳链球菌分离株的分子分型 本研究分别用多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和脉冲场电泳分型(Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)构建了102株无乳链球菌临场分离株的系统发生树。结果显示，102株试验菌分属6个序列型(sequencetype，ST)，即ST103，ST568，ST67，ST301，ST313和ST570。其中ST568和ST570为本研究发现的新ST型。eBURST软件分析发现这6个序列型分属于CC103，CC67和CC64三个克隆群(clonal complexes，CCs)。PFGE分析将这些菌株划分为27个型，其中型7，8，14，15，16，18，23和25为优势PFGE型，占所有菌株的70％(71/102)。结合荚膜类型、α相关蛋白类型、菌毛类型进行分析，结果确定主要流行菌株为ST103(58％)和ST568(31％)、荚膜分子Ia型且α相关蛋白未能定型。新的ST型及α相关蛋白未定型等新的分子特征的出现，显示该地区牛源无乳链球菌有区域特性。荚膜为Ia(89％)和Ⅱ型(11％)，所有菌株的菌毛都是2b型。保守的菌毛类型为牛无乳链球菌乳腺炎亚单位疫苗的研制提供了候选蛋白。 5、BP亚单位苗免疫效力的测定 本实验克隆表达了牛源无乳链球菌菌株HAN201101的菌毛蛋白(BP)，Western blot分析显示，重组BP能与HAN201101全菌制备的兔抗血清发生特异性反应。进一步以小鼠为试验模型，用ELISA方法检测BP亚单位苗免疫组小鼠的抗体效价水平，用同源菌株攻击免疫母鼠泌乳期乳腺。结果，二免后BP亚单位苗组小鼠的抗体水平显著高于HAN201101全菌油苗免疫组(P＜0.001)。攻毒24小时后，BP亚单位苗免疫组小鼠乳腺的细菌回收数量显著低于全菌油苗组和对照组。镜检小鼠乳腺的病理切片可见，BP亚单伟苗免疫组的病变明显轻于全菌油苗免疫组和PBS对照组，乳腺腺泡清晰可见，有望作为预防牛无乳链球菌乳腺炎的亚单位疫苗。