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目的:通过对博尔纳病病毒在体内对重症联合免疫缺陷鼠的感染性、体外对DNA依赖蛋白激酶缺陷细胞的感染性的研究,以及对相关细胞因子在体内外变化情况的分析,阐明DNA依赖蛋白激酶对BDV感染及增殖的影响。
方法:体内实验中,我们选择Wistar大鼠、裸大鼠(Nude Rat,RNU)、BALB/e小鼠、BALB/c裸小鼠(BALB/c-nu)和重症联合免疫缺陷小鼠(SCID)进行BDV脑内接种感染实验和BDV持续感染人少突胶质瘤细胞(OL/BDV)脑内接种实验,4周后通过免疫组化和原位杂交的方法检测BDV的感染和增殖的情况;同时检测实验动物血清中细胞因子的变化。体外实验中,我们设计了DNA依赖蛋白激酶shRNA干扰表达载体pGPU6-PKcsi和阴性对照质粒pGPU6-NCi,并分别转染人少突胶质瘤细胞(OL),建立稳定的RNA干扰细胞系OL PKesi和对照细胞系OL Nci,用BDV感染该细胞系并通过免疫荧光和免疫印记的方法检测BDV的感染和增殖的情况;并应用酶联免疫吸附法和荧光定量PCR的方法检测细胞因子的变化。同时选用DNA依赖蛋白激酶缺陷的M059J细胞和对照细胞M059K作为研究对照。
结果:BDV脑内接种动物中,Wistar大鼠、裸大鼠、BALB/c小鼠、BALB/c裸小鼠都可以在动物脑组织中检测到BDV的复制,但是SCID小鼠脑内未检测到BDV的核酸与蛋白。用OL/BDV细胞直接脑内接种的实验动物中,Wistar大鼠、裸大鼠、BALB/c小鼠、BALB/c裸小鼠的脑内可以检测到OL/BDV细胞成瘤性生长,瘤体内和脑组织中都可以检测到BDV抗原。SCID小鼠脑内OL/BDV细胞瘤体较大,其中有BDV增殖,但瘤体周围及其它部位脑组织中未检测到BDV。进而发现在BDV接种后BALB/c裸小鼠和SCID小鼠血清中可以检测到IFN-α表达增加,但是SCID小鼠血清中IFN-a的表达早于BALB/c裸小鼠。BDV体外感染实验显示,BDV可以感染DNA依赖蛋白激酶低表达的RNA干扰细胞系OL PKcsi,但是BDV复制过程受到明显的抑制。通过进一步检测OL PKcsi细胞系中细胞因子水平检测发现,当DNA-PKcs基因表达下调时,细胞中IFN-α水平呈上调的趋势。但BDV感染OL PKcsi后可以抑制了IFN-α的表达。热休克蛋白HSP70、HSC70和HSP105的mRNA水平在OL PKcsi细胞中也有上调。另外,在DNA-PK缺陷的M059J细胞中白细胞介素(IL)6和8也有上调。
结论:BDV可以感染裸大鼠(RNU)和裸小鼠(BLAB/c-nu),但是不能感染DNA-PK缺陷的SCID小鼠。通过RNAi技术下调OL细胞DNA-PKcs基因表达,不影响BDV侵入OL细胞,但抑制BDV在细胞内的复制过程。IFN等细胞因子上调参与了DNA-PK缺陷导致的BDV增殖抑制过程。