目前,刺参养殖已成为中国北方最大的海水养殖种类,养殖面积达7万公顷,遍布江苏北部、山东、辽宁、河北等地,年产值约200亿元。然而,频繁发生的刺参病害问题给刺参养殖业造成了巨大的经济损失,严重制约了该产业的健康、持续发展。抗生素及消毒药物的使用能一定程度缓解疾病的发生,但由于其能在养殖动物体内残留,并进而威胁人类健康,而且大量使用能导致耐药菌株滋生,目前其使用已受到严格限制。刺参养殖量大,而且不具有特异性免疫,因此通过疫苗控制刺参病害也不可行。益生菌由于能够抑制病原微生物、调节动物肠道微生态环境、增强养殖动物免疫力,且绿色环保。因此,人们开始越来越多的关注益生菌在刺参养殖中的应用研究。本论文分4部分。1.采用形态学、生理生化指标测定以及16S rDNA序列分析等方法,鉴定了3株病原拮抗菌。菌株TYIA-16、TYIA-25’、TYIA-26分别被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)。其中,屎肠球菌能耐低温,在0℃的极端低温下也可生长。2.研究了菌株TYIA-12(Bacillus atrophaeus)、TYIA-15’(Bacillus subtilis)、TYIA-16(Bacillus subtilis)及TYIA-25’(Bacillus cereus)的生长特性,得到了试验菌的最适生长条件以及最佳的发酵时间。由于刺参特殊的生活习性,冬春季是其发病高峰期,因此进行了菌株的温度试验,结果表明试验菌株耐高温,但低于6℃不能生长,因此在极低温度下需与其它低温菌种混合使用。试验菌株均能有效的降解海参饵料,并利用其大量增殖。菌株之间的拮抗试验发现菌株TYIA-15’能强烈抑制其余3株菌的生长。刺参营底栖生活,主要以底泥、硅藻、细菌、有机碎屑为食,施用的益生菌如何能有效到达池底并被刺参摄食是一个有待解决的问题。本试验选择沸石粉(粒径<80目)作为芽孢杆菌孢子的载体,结果表明,沸石粉对试验菌的吸附率达95%以上。沸石粉投入水体后迅速下沉,95%以上的沸石粉可沉入底部,且对刺参安全无害,因此可作为有益菌的有效载体应用于刺参养殖。试验并以沸石粉为载体,制备了芽孢杆菌的活性制剂(活菌量>1.5×109cfu/g),结果表明,芽孢杆菌活性制剂能长时间保持活性,存放半年后的存活率均在70%以上。3.将基础饵料为对照,分别在饵料中添加1%的单一芽孢杆菌制剂(TYIA-1)和复合芽孢杆菌制剂(TYIA-12:TYIA-16:TYIA-25’=1:1:1)投喂刺参(制剂中活菌量为1.5×109cfu/g),以研究芽孢杆菌制剂对刺参生长、免疫以及肠道菌群的影响。结果显示,芽孢杆菌制剂能显著提高刺参的特定生长率(SGR)及肠道蛋白酶活性(P<0.05),但降低了刺参肠道淀粉酶活力。体腔液中免疫指标的测定发现芽孢杆菌制剂能显著提高体腔液中碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性(P<0.05),对超氧化物歧化酶(SOD)活性无显著影响。试验组刺参攻毒后的累计死亡率均低于对照组,其中,投喂复合菌剂组与对照组差异显著(P<0.05)。试验还表明,芽孢杆菌制剂对刺参肠道菌群具有一定的调节作用。试验还研究了单一芽孢杆菌制剂对刺参养殖水质的影响。结果显示,试验组的溶解氧(DO)略有降低,但对pH值无影响;菌株TYIA-15’和TYIA-16能一定程度抑制氨氮浓度的增加;试验组芽孢杆菌数量先逐渐上升,12~15天达到高峰后开始下降,对照组没有检测到芽孢杆菌。4.从感染“腐皮综合征”的刺参病灶处分离得到1株优势细菌HP1,经回接感染试验证实其为刺参病原菌,采用形态学、生理生化指标测定以及16S rDNA序列分析等方法将其鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。蜡样芽孢杆菌通常作为益生菌应用于畜禽及水产养殖中,本试验发现蜡样芽孢杆菌HP1菌株能引起刺参“腐皮综合征”,建议在水产养殖中要谨慎使用,以避免损失。本论文以从健康刺参肠道中分离得到的有益菌作为研究对象,制备了有益菌的活性制剂,并验证了其在刺参养殖中的益生作用。刺参营底栖生活,以底泥、硅藻、细菌、有机碎屑等为食,且养殖过程中基本不投饵。因此,施用的有益菌如何有效的到达池底,减少在水中的损失是使用的关键技术。本研究表明沸石粉能够作为有益菌的有效载体,为益生菌在刺参养殖中的使用提供了途径和方法。试验验证了芽孢杆菌制剂对刺参养殖的有益作用,表明其能缓解刺参疾病的发生,为研究刺参的病害防治工作提供了理论依据和实践基础。目前,水产养殖中使用的益生菌多为外来菌种,大量使用将有可能导致外来菌种入侵。本研究所用菌株分离自健康养殖刺参肠道中,可避免因使用外来菌种引起的生态问题,并为益生菌的应用研究以及国产化产品的开发奠定了基础。