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氧的利用和调节是高等生物生存的基本条件，而低氧性损伤和适应参与了许多病理生理过程及一些疾病的发生，如窒息、高原反应、缺血、脑中风、心肌梗死，以及癌细胞耐药和转移等。缺血/低氧预适应(Ischemic/hypoxicpreconditioning，I/HPC)最初于1986年由美国学者Murry在心脏组织中发现，随后人们又在脑、肺、肝和肾等组织器官中观察到了类似现象。HPC是一种内源性保护机制，即亚致死性缺血/低氧预刺激可诱发组织器官对继发严重缺血/低氧所致损伤产生耐受。脑I/HPC引起的保护机制为临床寻找防治缺血/低氧性脑损伤的策略提供了新思路，但目前关于其发生发展的细胞分子机制尚不清楚。利用已建立小鼠整体I/HPC模型，我们曾发现，随着低氧暴露次数的增加，小鼠低氧耐受时间明显延长，并且蛋白激酶C(PKCs)家族的10个亚型中，经典型PKC(cPKC)βⅡ和γ，以及新奇型PKC(nPKC)ε膜转位水平(激活程度)在脑组织内明显增高，提示它们可能参与了小鼠脑I/HPC的发生发展过程。然而，这种I/HPC是否能够减轻小鼠脑缺血性损伤，以及cPKCβⅡ、γ和nPKCε在其中的作用还不清楚。据此，本研究拟利用小鼠I/HPC和左大脑中动脉阻塞(MCAO)所致脑局灶缺血模型，通过观察缺血后脑梗死面积、水肿率、神经行为学改变和神经细胞丢失等，来探讨I/HPC对MCAO诱发脑缺血性损伤的影响；同时，应用cPKCγ抑制剂(G06983)和PKC非亚型特异性激动剂(PMA)，探讨cPKCγ膜转位(激活)和蛋白表达量改变在I/HPC保护缺血性脑组织中的作用。所获研究结果将进一步丰富人们对脑I/HPC信号转导机制的认识。
实验在室温20-22℃下进行，选用成年雄性BALB/c小鼠(12—14w，18—22g)，动物实验方法按照美国国立卫生研究院(NIH)制定的《实验动物饲养和使用》指南(NIHPublicationNo．80-23)进行。实验动物随机分为假手术(S)、缺血(I)、I/HPC+I、I/HPC+Go6983+I，以及PMA+I等5组。小鼠在I/HPC(低氧暴露4次)处理后1小时，再进行MCAO缺血模型的制备，手术后6小时对小鼠的神经行为学改变进行评分和TTC染色，以及脑梗死面积、梗死区密度值和水肿率的分析。然后，收集缺血核心区(Ic)、半影区(P)和缺血对侧皮质(C)组织，进行胞浆、膜相关及胞膜蛋白组分的提取。应用蛋白印迹(Westernblot)方法，观察I/HPC对小鼠脑缺血核心区，半影区及缺血对侧皮质组织内cPKCγ膜转位水平及蛋白表达量变化的影响。同时，应用尼氏(Nissl)染色，观察I/HPC对小鼠脑缺血半影区神经细胞丢失的影响，并分别进行侧脑室和腹腔注射Go6983和PMA，观察cPKCγ膜转位水平对I/HPC脑保护作用的影响。实验数据使用单一因素方差分析(OnewayANOVA)和Bonferroni检验进行统计学处理，并以均数±标准误(X±S.E.)表示，其中p<0.05为差异显著。实验结果如下：
1.随着低氧暴露次数的增加，小鼠对低氧的耐受时间逐渐延长与低氧暴露1次(H1，17.8±0.6min)相比，重复低氧暴露2次(H2，25.4±0.8min)、3次(H3，30.8±0.9min)和4次(H4，35.6±1.3min)小鼠的低氧耐受时间明显增加(p<0.05，n=50)，提示本实验成功地制备了小鼠I/HPC模型。以下I/HPC小鼠特指低氧暴露4次组小鼠。
2.小鼠MCAO可诱发皮层、海马和丘脑等3种脑缺血模式经TTC染色证实，MCAO可诱发明显的小鼠局灶性脑缺血，其手术成功率约为79％。我们还发现MCAO可诱发皮层、海马和丘脑等3种典型缺血模式，其中皮层缺血约占40.3％，海马缺血约占39.0％，丘脑缺血约占7.3％，联合缺血(同时包括皮层和海马缺血)约占13.4％。其中小鼠MCAO缺血模型可诱发海马和丘脑缺血为本实验室首次报导。
3.I/HPC明显缓解MCAO所致小鼠神经行为学改变缺血后6小时进行小鼠神经行为学评估。在单项神经行为学指标中发现，皮层和海马局灶性缺血损伤都可导致明显的神经行为改变，如运动减少、姿势侧倾、拖地步态、转圈、低反应性、前肢屈曲、前肢肌力下降和运动失调等，而I/HPC可明显缓解这些神经行为学改变；在神经行为学综合评价中，I/HPC同样明显改善小鼠皮层或海马缺血后神经行为学的综合评分(p<0.05，n=20)。
4.I/HPC明显降低小鼠脑梗死面积、水肿率和梗死区密度值TTC染色证实，MCAO可诱发明显的小鼠局灶性脑缺血。在皮层缺血模式中，梗死体积约占全脑35％，脑水肿率约为5％；与单纯缺血组相比，I/HPC明显降低MCAO所致局灶性脑缺血梗死体积(p<0.05，n=12)，脑水肿率(p<0.05，n=12)和梗死区密度值(p<0，05，n=12)。在海马缺血模式中，I/HPC明显降低缺血梗死区密度值(p<0.05，n=12)，但是未明显降低脑梗死体积和水肿率。
5.I/HPC明显缓解缺血半影区神经细胞的丢失缺血半影区神经细胞丢失在不同时间点(缺血后0，6，12和24小时)通过Nissl染色进行研究。结果显示在缺血后6小时，部分神经细胞呈现出坏死形态学改变如核固缩，核碎裂等，而在缺血后12和24小时，几乎所有的神经细胞都呈现明显坏死形态学改变。我们采用缺血后6小时作为实验观察点，发现I/HPC明显缓解脑缺血所致神经细胞的丢失(p<0.05，n=6)。
6.I/HPC对缺血组织内cPKCγ膜转位和蛋白表达量的影响在I/HPC对缺血小鼠脑内cPKCγ膜转位水平影响的研究中发现，在缺血后6小时，cPKCγ膜转位水平在缺血核心区和半影区都明显下降，而I/HPC可明显缓解这种MCAO所致cPKCγ膜转位水平的降低(p<0.05，n=6)。在缺血24小时后，同样，cPKCγ膜转位水平在缺血核心区和半影区也都明显下降，然而I/HPC却不能缓解cPKCγ膜转位的下降。本结果表明，I/HPC可能通过增高cPKCγ膜转位水平减轻脑缺血损伤。
本研究还显示，缺血损伤明显降低缺血核心区及半影区cPKCγ的蛋白表达水平(p<0.05，n=6)，但无论在缺血后6小时还是24小时，I/HPC都不能缓解这种MCAO所致cPKCγ蛋白表达量的降低(p>0.05，n=6)。
7.cPKCγ抑制剂和PKCs激动剂对I/HPC脑保护作用的影响侧脑室注射cPKCγ抑制剂G06983(6nmol/L)可明显抑制缺血核心区、半影区和对侧皮层组织内cPKCγ的膜转位水平。与I/HPC+I组相比，Go6983明显增高脑缺血梗死体积(p<0.05，n=6)、梗死区密度值(p<0.05，n=6)和水肿率(p<0.05，n=6)。而注射Go6983溶剂DMSO(0.1％)并没有明显影响脑缺血梗死体积，梗死区密度值和水肿率。结果提示cPKCγ膜转位的抑制减弱了I/HPC对缺血脑组织的保护作用。
此外，腹腔注射PKC非亚型特异性激动剂PMA(0.15mg/kg)明显增高缺血核心区、半影区和对侧皮层组织内cPKCγ的膜转位水平。与单纯缺血组相比，PMA明显减小梗死区密度值(p<0.05，n=6)和水肿率(p<0.05，n=6)，但对梗死体积影响不大。结果提示PKC非亚型特异性激活可部分模拟I/HPC的脑保护作用。
综上所述，本研究发现MCAO可诱发小鼠皮层、海马和丘脑等3种典型缺血模式；I/HPC明显减轻MCAO所致脑缺血性损伤，即减小缺血梗死面积，降低脑水肿率和梗死区密度值，以及缓解缺血半影区神经细胞的丢失和缺血所致神经行为学的改变；在此基础上，我们进一步发现I/HPC可缓解缺血所致cPKCγ膜转位水平的下降，同时，应用cPKCγ抑制剂G06983和PKC激动剂PMA发现，特异性抑制cPKCγ激活或PKC非亚型特异性激活可分别减弱或部分模拟I/HPC的神经保护作用。本研究所获成果不仅丰富了人们对脑I/HPC信号转导机制的认识，而且为我们后续分离、鉴定与I/HPC神经保护作用相关的已知或未知信号蛋白奠定了基础。同时，也为临床上开发抗缺血/低氧性脑损伤药物提供一定的实验依据。