1研究背景高效抗反转录病毒疗法(Highly active antiretroviral therapy,HAART)是治疗艾滋病最有效的方法,使艾滋病的发病率和死亡率大大下降。但是研究发现,即使患者HAART后依从性良好,血浆病毒载量长时间控制在不可检测的水平,约30%患者的CD4+T淋巴细胞计数仍然低于正常值。具有这种免疫无应答状态的艾滋病患者,其死亡率、发病率和机会性感染发生率均高于“免疫学应答良好”的患者。有研究发现免疫无应答者的长期并发症发生率及死亡率是免疫应答良好者的10倍。因此对于免疫无应答发生机制研究及干预的尝试成为后HAART时代的研究热点。从目前中医药干预免疫无应答研究的总体情况来看,大多数研究还仅仅停留于中医药干预前后CD4+T淋巴细胞计数变化、纯真型和记忆型T淋巴细胞变化等研究,对免疫无应答的重要影响机制:固有免疫系统和获得性免疫系统的异常激活相关指标的研究较少。而“免疫异常激活”近年被认为是免疫无应答的重要影响机制之一。目前,国外开展了一些应用免疫抑制剂来治疗免疫无应答患者免疫功能重建的研究。中医药治疗特色在于对机体阴阳虚实失衡的状态进行整体调节。对机体免疫系统的抑制与激活的状态进行适度调整,是中医调和阴阳思想在机体免疫调节方面的重要体现。因此,中医药能否通过多靶点作用、双向调节干预免疫无应答患者的异常激活,促进免疫重建,提高HAART疗效,值得研究探索。针对异常免疫激活的机制开展研究,阐明中医药干预免疫无应答状态的作用机理意义重大,机遇与挑战并存。一些国外研究已经将T淋巴细胞激活亚群的检测应用于作为评价HAART治疗药物疗效和患者免疫功能恢复的指标,国内仍然沿用CD4+T淋巴细胞作为金指标,而T淋巴细胞激活亚群的相关报道较少。临床工作中,我们时常会发现一部分患者的CD4+T淋巴细胞计数虽然高于350个/mm3,却已发生严重的机会性感染;而一些患者的CD4+T淋巴细胞计数虽然低于350个/mm3,却状态良好,即使是实验室指标无明显差异的个体之间,疾病进展的快慢和临床表现也各有不同。这些情况表明仅以CD4+T淋巴细胞计数作为唯一指标衡量治疗药物疗效和机体免疫功能恢复方面存在不足。结合血浆病毒载量的测定可能解决上述问题,但该方法也存在技术上(所要求的实验条件高,检测时间长)检测和经济上(费用昂贵,千元以上)的困难。因此,除CD4+T淋巴细胞计数的指标外,从异常免疫激活亚群及调节性T细胞方面开展中医药疗效作用机制及干预效果的评价研究,是非常必要的。本研究论文依托国家自然科学基金课题(81403271),由昆明市中医院和沈阳市第六人民医院两家医疗单位参与临床实施,在沈阳市第六人民医院伦理委员会通过伦理审查,批件号:2016-05-001-02号。本人在研究项目中完成该课题的设计、日常管理、患者随访、临床监察等工作,撰写技术总结报告。对随机双盲入组的60例受试者的临床数据进行分析,得出初步结论。2目的本研究应用温肾健脾方联合HAART疗法对60例免疫无应答患者进行随机、双盲、安慰剂对照研究,比较干预前后外周血CD4+T淋巴细胞计数、纯真及记忆型T淋巴细胞计数变化,观察其是否可以改善患者的免疫无应答状态。同时对其干预机制进行深入研究,主要观察其是否可以抑制试验组患者的T淋巴细胞免疫激活水平,是否通过抑制NK细胞活化达到促进免疫重建的目的,以及是否通过影响调节性T淋巴细胞Treg途径达到免疫调节的目的。3方法随机、双盲、安慰剂平行对照的临床研究设计,采用统计软件产生随机数字表,由中国中医科学院临床评价中心实现随机过程,符合纳入标准受试者通过中央随机系统获得随机号(即药物编号),按1:1比例随机分为治疗组和安慰剂对照组。4结果4.1 一般资料共入组患者56例,其中治疗组28例、对照组28例。对研究人群进行划分,56例受试者进入FAS人群,两组分别为28例,52例受试者进入PPS人群,治疗组24例,对照组28例,脱落/剔除4例。本研究受试者83.93%感染途径为性传播,其中异性性传播占7.14%,男男同性性传播76.79%,静脉吸毒者占 5.36%,采供血途径感染未发现,其他不明原因感染者占8.93%。说明本研究受试者以经同性性传播途径为主;治疗组CD4+细胞计数基线均值为207.41±66.4个/mm3,对照组均值为228.28±60.05个/mm3,在200-350个/mm3这个区间,均属于免疫不完全应答人群。未发现合并HBV或HCV感染。4.2两组患者外周血CD4+T淋巴细胞计数、纯真及记忆型T淋巴细胞计数的变化治疗组比对照组更有效提高患者外周血CD4+T淋巴细胞计数水平,这种增长随着治疗时间的延长越来越显著,在治疗第24周时治疗组CD4+T淋巴细胞绝对值增加了 79.52个/mm3,对照组减少了 11.11个/mm3,组间比较有统计学差异(P=0.011)。同时治疗组CD8+T淋巴细胞计数也较对照组明显上升,有统计学差异(P=0.034)。治疗组CD4+T淋巴细胞计数的增长以CD4+CD45RA+即纯真型CD4+T淋巴细胞的增长为主。治疗组CD4+CD45RA+从基线9.36±9.53个/mm3上升到第24周时的24.96±14.83个/mm3,对照组基线值为19.92±16.20个/mm3,第24周时为20.64±19.04个/mm3,对照组基本持平。4.3 两组患者 T 淋巴细胞激活亚群 HLADR+CD38+/HLADR+CD38-/HLADR-CD38+占CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞比例的变化1)HLADR+CD38+T淋巴细胞激活亚群占CD4+T淋巴细胞比例:第12周时治疗组比值明显下降,对照组基本持平,两组比较有统计学差异(P=0.033)。第24周时对照组较基线水平显著下降,治疗组回升到基线水平附近,两组比较有统计学差异(P=0.01)。2)HLADR+CD38-T淋巴细胞激活亚群占CD4+T淋巴细胞比例:第12周时治疗组比值明显下降,对照组比值显著上升,两组比较有统计学差异(P=0.034)。24周时,对照组比值下降,而治疗组明显上升,两组比较有统计学差异(P=0.036)。3)HLADR+CD38+T淋巴细胞激活亚群占CD8+T淋巴细胞比例:第12周时治疗组比值明显下降,对照组比值显著上升,两组比较有显著统计学差异(P=0.002)。24周时,对照组比值下降,而治疗组明显上升,两组与基线差值比较没有统计学差异(P=0.063)。4)HLADR+CD38-T淋巴细胞激活亚群占CD8+T淋巴细胞比例:第12周时两组比值均上升,对照组上升幅度明显大于治疗组,两组比较有统计学差异(P=0.010)。24周时,对照组比值显著下降,治疗组继续上升,两组与基线差值比较有显著统计学差异(P=0.001)。5)HLADR-CD38+T淋巴细胞激活亚群占CD4+T淋巴及CD8+T淋巴细胞比例:第12周和24周两组与基线差值比较均没有发现明显统计学差异(P>0.05)4.4各T淋巴细胞激活亚群比例和CD4+T淋巴细胞计数的相关性HLADR+CD38+/CD4+比值及HLADR-CD38+/CD4+比值均与CD4+T淋巴细胞计数呈正相关(P<0.05),而其他几个T细胞激活亚群的指标与CD4+T淋巴细胞计数未发现相关性(P>0.05)。4.5两组患者NK细胞激活亚群CD56bri、CD56neg、CD56dim变化1)第12周两组CD56bri与基线差值比较有显著统计学差异(P=0.002),治疗组CD56bri较基线降低-0.92±3.17个/mm3,对照组CD56bri 比基线升高3.26±5.72个/mm3;第24周治疗组CD56bri比基线升高1.5±3.26个/mm3,对照组CD56bri比基线升高3.35±4.2个/mm3,两组与基线差值比较没有统计学差异(P=0.098)。2)第12周两组CD56neg与基线差值比较有显著统计学差异(P=0.001),治疗组 CD56neg 较基线降低 24.92±97.96 个/mm3,对照组 CD56neg比基线升高93.52±69.08个/mm3;第24周治疗组比基线升高24.92±53.03个/mm3,对照组比基线升高90.00±110.00个/mm3,两组与基线差值比较具有明显统计学意义(P=0.013)。3)第12周两组CD56dim与基线相比均有升高,但没有统计学差异(P=0.075);第24周治疗组比基线升高0.75±73.20个/mm3,对照组比基线升高89.04±128.98个/mm3,两组与基线差值比较有显著统计学差异(P=0.006)。4.6 NK细胞激活亚群与CD4+T淋巴细胞计数的相关性CD56bri与CD4+T淋巴细胞计数存在非常明显的正相关(P=0.001),而CD56neg、CD56dim这两个NK细胞亚群的指标与CD4+T淋巴细胞计数未发现相关性(P>0.05)。4.7两组患者调节性T细胞CD4+CD25+Treg淋巴细胞变化第12周两组CD4+CD25+Treg淋巴细胞绝对值与基线相比均有降低,但差异没有明显统计学意义(P=0.093);第24周治疗组比基线升高26.81±43.13个/mm3,对照组比基线降低106.64±137.52个/mm3,两组与基线差值比较有显著统计学差异(P=0.006)。相关性分析显示调节性T细胞CD4+CD25+Treg淋巴细胞与CD4+T淋巴细胞计数存在明显的线性相关性,呈正相关(P=0.020)。5结论5.1温肾健脾方联合HAART疗法可以较对照组有效提高患者外周血CD4+T淋巴细胞计数水平,这种增长随着治疗时间的延长越来越显著。CD4+T淋巴细胞计数的增长,主要是纯真型CD4+T淋巴细胞的增长。中医理论认为“肾主骨,骨生髓”,可以推测以温肾健脾为治法的中医药干预主要促进胸腺功能恢复,从而促进CD4+T淋巴细胞的生成。5.2温肾健脾方治疗相关的免疫激活水平的调节主要与HLADR+CD38+以及HLADR+CD38-的CD4+T淋巴及CD8+T淋巴细胞有关,HLADR-CD38+没有发现显著统计学差异。治疗组 HLADR+CD38+/HLADR+CD38-/HLADR-CD38+占 CD4+T 淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞比例均呈现先下降后回升的态势,对照组则呈现先上升(或持平)后下降的相反态势。说明温肾健脾方对CD4+T淋巴细胞计数的提升不是通过单纯抑制(下调)的途径,更可能是对其抑制与激活状态的双向调节(先下调后回升)。5.3温肾健脾方治疗能较好下调CD56bri和CD56neg的水平,与对照组这两者水平持续上调的表现有显著统计学差异;对CD56dim则表现为抑制上调的作用,与对照组持续上调对比显著,差值高达88.29个/mm3。说明温肾健脾方对CD4+T淋巴细胞计数的提升可能通过下调或抑制NK细胞激活亚群上调的途径。5.4调节性T细胞CD4+CD25+Treg与CD4+T淋巴细胞计数存在明显的正相关;而且第24周时治疗组比对照组升高显著。基本支持Treg是免疫功能重建的保护性因素这一观点。可以认为温肾健脾方帮助免疫重建的机制与Treg上调有关,推测该中药复方在本研究中的作用是通过影响Treg途径来实现,而文献显示雷公藤多甙抑制免疫激活并非通过此途径。这可能成为温肾健脾、扶正固本类中药复方有别于雷公藤类免疫抑制剂促进免疫重建机制研究的突破口。本研究存在例数少及观察时间短的局限性,有待将来的临床研究和动物实验研究进一步验证。