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背景:近年来,骨组织工程的发展为解决临床上骨缺损或骨缺失等问题提供了可能。诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell,iPSC）是从人体细胞重新编程的一种具有多向分化潜能的多能干细胞,是骨组织工程中颇具前景的细胞来源。为了防止与细胞全能性相关的肿瘤发生,iPSC通常分化成间充质干细胞样细胞用于体内应用,称为iPSC来源的间充质干细胞（iPSC-derived MSC-like cells,iMSC）。然而如何安全、稳定且高效地诱导iPSC成骨向分化仍然是一个挑战。大量研究表明低频脉冲超声（Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS）可以作为一种无创、安全的方法用作骨改建和骨再生,是一种安全的促进骨折愈合的治疗手段。然而LIPUS促进iPSC的成骨向分化的作用及机制仍有待进一步研究。目的:1、明确LIPUS促进iPSC来源的iMSC成骨向分化的作用并筛选出促进其成骨向分化的最佳参数。2、进一步通过体内、体外实验探究LIPUS促进iMSC成骨向分化的作用并且初步探索其机制。3、研究LIPUS是否通过影响体内的血管生成或者炎症影响iMSC成骨向分化。方法:1、通过设计不同输出强度和占空比的参数组合的LIPUS刺激iPSC来源的iMSC,CCK-8检测细胞的增殖情况,并利用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatases,ALP）检测试剂盒检测成骨早期碱性磷酸酶的表达情况,以筛选出促进iMSC成骨向分化的最佳参数。在最佳参数下,分别利用LIPUS刺激iPSC以及EB后,通过观察细胞生长情况以及进行成骨分化诱导和茜素红染色来探索LIPUS能否简化iPSC的成骨分化过程。2、在LIPUS最佳参数刺激下进行体外诱导iMSC的成骨分化,通过RT-q PCR检测成骨分化相关基因（Runx2、COL1A1、OCN）的表达、二甲酚橙染色监测成骨情况、茜素红染色来进一步验证LIPUS促进iMSC的成骨分化潜力。在iMSC成骨诱导培养中分别加入Wnt/β-catenin通路拮抗剂（Cardamonin）或BMP2通路拮抗剂（Noggin）,通过RT-q PCR检测成骨分化相关基因的表达、茜素红染色初步探讨Cardamonin和Noggin在LIPUS促进iMSC成骨分化的通路的作用。通过建立小鼠颅骨临界骨缺损模型,制作负载iMSC的藻酸盐微球作为体内细胞给药途径,再植入缺损区包含iMSC的藻酸盐微球,隔日一次接受LIPUS刺激后,12周后通过Micro-CT分析缺损区骨修复情况,HE染色观察新骨形成,抗人核免疫组织化学染色检测植入iMSC微球的迁移能力对骨修复区的影响。3、利用体内建立颅骨缺损模型的基础上,通过激光散斑血流成像仪在1W,4W,12W时检测颅骨缺损区血流量的变化以分析LIPUS刺激下的缺损修复中影响成血管的改变。并通过检测炎性相关因子TNF-α、IL-10免疫组织化学染色切片分析微球植入后引起的炎症反应对于缺损区骨修复的间接影响。结果:1、在不同的参数组合下的LIPUS对iMSC刺激后,细胞增殖和早期碱性磷酸酶的表达情况显示输出强度为40m W/cm~2和占空比为50%（LIPUS40/50）是促进iMSC成骨向分化的最佳参数,同时初步明确了合适的参数设置明显提高了iMSC成骨向分化潜能。通过暴露于LIPUS40/50下培养EB和iPSC,生长情况、流式分析和茜素红染色结果显示接受LIPUS刺激可能会加速拟胚体（EB）到间充质干细胞（iMSC）的转化,但不能直接驱动iPSC或EB的成骨向分化。2、体外实验中,在LIPUS40/50刺激下iMSC的成骨潜力明显高于未接受LIPUS刺激的iMSC,RT-q PCR分析结果显示iMSC+LIPUS40/50组在第7天时Runx2的表达水平以及第14天时COL1A1、OCN的表达水平明显高于对照组,二甲酚橙染色结果显示接受LIPUS40/50刺激的iMSC组与对照组相比成骨分化更早、钙结节更多,茜素红染色显示LIPUS40/50刺激21天后iMSC成骨情况相较于未接受刺激的明显升高。在加入Cardamonin和Noggin后,RT-q PCR和茜素红染色结果显示Cardamonin更明显的抑制iMSC的成骨潜能。体内实验中,小鼠颅骨缺损中植入负载iMSC的微球后,LIPUS40/50刺激组与非刺激组相比,Micro-CT和HE染色结果显示LIPUS40/50刺激组的新生骨数量明显增加,同时抗人核免疫组织化学染色结果显示新生骨周围明显的阳性染色验证iMSC迁移能力对新骨形成的影响。3、在体内实验的基础上,激光散斑血流成像仪分析颅骨缺损区血流量显示LIPUS刺激下植入iMSCs微球后不能增加血供。免疫组织化学染色结果显示实验组TNF-α染色强阳性、IL-10染色弱阳性,显示LIPUS刺激下引起了较明显的炎症反应。结论:本研究明确了LIPUS对iPSC来源的iMSC细胞成骨分化的显著影响,同时筛选出了可能诱导iMSC向成熟成骨表型发展的最佳参数。虽然LIPUS40/50未能简化经典的iPSC-EB-iMSC分化过程,然而通过设置合适的参数后LIPUS可以明显促进iPSC来源的iMSC的成骨分化。LIPUS有望成为一种很有前途的建立iPSC骨再生工程应用模型的方法。