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研究背景:LIPUS（Low-instensity Pulsed Ultrasound,低频脉冲超声）是近年来研究较多的一种利用声辐射力产生的机械刺激对细胞产生作用,进而发挥治疗效用的治疗手段,LIPUS能调节多种干细胞的生物行为能力,还可促进牙周膜干细胞（PDLSCs）成骨分化,从而促进骨缺损的修复再生。骨组织再生过程与周围微血管的新生关系密切,然而LIPUS在PDLSCs的内皮分化及其微血管形成过程中的作用及调控机制尚不清楚。目的:本研究的目的是研究LIPUS对炎症或非炎症状态PDLSCs的内皮分化及成血管作用的影响,以及机械敏感性离子通道Piezo1参与LIPUS对PDLSCs调控机制的研究。方法:第一部分:通过酶消化法分离健康年轻人恒牙牙周膜,获取牙周膜干细胞,进行体外培养,并对所获细胞的多向分化能力及干细胞表面抗原进行鉴定;CCK-8法比较牙周膜干细胞经不同浓度LPS刺激后的细胞增殖能力差异,筛选LPS的实验刺激条件。第二部分:RT-PCR检测筛查不同强度LIPUS刺激对成骨诱导培养基培养后的PDLSCs中ALP活性影响的最佳强度,以最佳强度为实验条件,茜素红染色进一步比较确认LIPUS处理与不处理的矿化差异。RT-PCR检测筛查不同强度LIPUS刺激对内皮诱导培养基培养的PDLSCs中CD31表达的最佳强度,以最佳强度为实验条件,经流式细胞术比较LPS刺激或不刺激时,LIPUS处理与不处理PDLSCs的CD31表达差异,采用相同设计分组,Martrigel基质胶体外成管试验检测诱导后的细胞的体外成管能力差异。第三部分:RT-PCR检测筛查:a.不同强度LIPUS刺激对内皮诱导培养基培养的PDLSCs中Piezo1表达差异;b.不同浓度Gs MTx4刺激对PDLSCs中Piezo1活性抑制的最佳浓度。以最佳强度以及浓度为实验条件,WB结果再次确认Gs MTx4抑制效果,免疫荧光进一步比较确认Gs MTx4刺激或不刺激时,LIPUS处理后Piezo1的表达差异。流式细胞术、免疫荧光和PCR检测比较Gs MTx4刺激或不刺激时,内皮诱导后的PDLSCs中CD31表达差异,采用相同实验分组设计,Martrigel基质胶体外成管试验检测诱导后的PDLSCs的体外成管能力差异。结果:第一部分:通过酶消化法成功获得形似纺锤状的人牙周膜干细胞,显著粘附生长;流式检测细胞表抗结果为CD73（99.99%）、CD90（99.99%）、CD105（57.64%）、CD31（0.2%）、CD45（0.27%）;茜素红染色21天可看到明显矿化结节,油红“O”染色21天可看到细胞内脂滴形成;CCK-8结果显示经10μg/m L LPS刺激的牙周膜干细胞,增殖能力升高,PCR比较经10μg/m L LPS刺激的牙周膜干细胞与未经处理的细胞相比,能明显诱导PDLSCs的炎症状态,符合前人研究结果。第二部分:RT-PCR检测ALP的m RNA水平显示LIPUS处理PDLSCs后ALP的表达在强度为50 m W/cm~2处达峰值;茜素红染色表明PDLSCs经LIPUS处理后,形成的矿化沉积较对照组明显。细胞形态观察结果显示,在内皮诱导培养基中培养14天后的PDLSCs形态与HUVECs类似,状如鹅卵石样,RT-PCR检测CD31的m RNA水平显示LIPUS刺激对内皮诱导培养基培养的PDLSCs中CD31表达的最佳强度为50 m W/cm~2,表达变化趋势与之前ALP高度相似;流式细胞术表明LPS刺激或不刺激时,LIPUS处理后经内皮诱导的PDLSCs中CD31较未经LIPUS处理组表达升高,相同实验条件下,Martrigel基质胶体外成管试验表明,经LIPUS处理的实验组,形成的管腔更密集,管腔连接点更多,且长度更佳。第三部分:RT-PCR检测Piezo1的m RNA水平显示不同强度LIPUS刺激经内皮诱导培养基培养的PDLSCs后,在50 m W/cm~2的强度下Piezo1表达达到峰值;不同浓度Gs MTx4处理PDLSCs后,Piezo1活性在2μM浓度的Gs MTx4作用下抑制效果最明显。以最佳辐射强度以及最佳抑制浓度为实验条件,免疫荧光进一步比较结果显示PDLSCs经内皮诱导并且LIPUS处理后,Gs MTx4抑制组中Piezo1表达显著低于未抑制组。流式细胞术、免疫荧光和PCR检测PDLSCs经内皮诱导,LIPUS处理后的Gs MTx4刺激组,CD31表达水平显著低于未抑制组,相同实验处理下,Martrigel基质胶体外成管试验结果显示Gs MTx4刺激组的体外成管能力较未刺激组明显较差,管腔密度更低,血管连接点更少,血管长度更差。结论:本研究验证LIPUS可促进PDLSCs在炎症或非炎症状态下的体外内皮向分化及血管形成能力,且通过激活Piezo1通道实现正向调控作用,但体内机制还需进一步确认。