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目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方地区发病率非常高的恶性肿瘤之一,研究人群中鼻咽癌发生发展的早期诊断和干预的综合性防治策略具有重要的公共卫生学意义。已知癌干细胞(cancer stem cells,CSCs)的特性是其参与NPC致癌过程和导致NPC耐药和复发的关键因素,寻找抑制NPC干细胞的有效干预靶点有待研究。环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)与多种肿瘤的发生发展密切相关,其在环境因素诱导致癌作用与人群肿瘤诊断治疗中的作用是公共卫生与毒理学研究中关注的重要问题。COX-2是肿瘤干性的重要维持因子,我们前期研究证实COX-2参与诱导NPC干性侧群细胞(side population,SP)上调,肿瘤化学预防因子能够通过抑制核因子-kappaB(NF-κB)信号通路活化介导COX-2表达下调,抑制NPC细胞干性表型。本研究旨在进一步探讨COX-2在线粒体的亚细胞定位介导NPC细胞干性调控的线粒体动态学机制,并通过线粒体COX-2的干预调节化疗药物的抗肿瘤敏感性,研究结果可为人群NPC化学预防的潜在分子标志物筛查和靶向干预策略提供理论与实验依据。方法:1.采用GEO数据库进行NPC病例组织中COX-2基因(PTGS2)与线粒体分裂相关因子Drp1基因(DNM1L)表达的相关性分析。分选NPC细胞株(CNE1和CNE2)中干性SP与主群MP细胞,qRT-PCR、免疫印迹、免疫荧光等检测COX-2、Drp1和癌干性相关标志的mRNA和蛋白表达水平,分析SP和MP细胞线粒体动态学和干性表型的变化。2.构建COX-2基因敲低/高表达稳定细胞株,建立COX-2基因干预模型,采用siNC和siDNM1L建立Drp1基因干预模型,免疫印迹、免疫荧光实验检测COX-2、线粒体分裂相关因子与癌干性蛋白表达水平和线粒体动态学变化;邻位连接法检测COX-2与Drp1、p53与Drp1蛋白互相作用;流式细胞术分析SP细胞比例;有限稀释法测癌干性细胞比例;克隆形成实验评价细胞自我更新能力,探讨COX-2在线粒体分布的功能。3.选择NPC化疗药物5-FU为药物模型,天然植物化学物白藜芦醇(resveratrol,RSV)和非甾体类药物为COX-2的干预模型,Mdivi-1为Drp1的干预模型,免疫印迹、免疫荧光实验检测COX-2、线粒体分裂相关因子与癌干性蛋白表达水平和线粒体动态学变化;流式细胞术分析SP细胞比例;AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒测定细胞凋亡;噻唑蓝(MTT)颜色反应法检测细胞增殖能力;移植瘤实验分析成瘤性,免疫组化分析瘤组织中COX-2,线粒体分裂相关因子与癌干性蛋白表达水平,进行COX-2在线粒体分布的功能验证与NPC化疗敏感性分析。结果:1.GEO数据库中NPC人群肿瘤组织相对于非肿瘤组织中COX-2与Drp1的mRNA表达升高,且两者之间存在正相关性。SP比MP细胞的癌干细胞比例高,干性相关基因蛋白与mRNA表达量增加。SP相对于MP细胞,COX-2、线粒体分裂相关蛋白表达升高、线粒体碎片化程度增加,提示NPC细胞和组织中COX-2参与线粒体分裂增加上调NPC干性。2.COX-2高表达后,CNE1与CNE2细胞线粒体定位的COX-2增多,线粒体碎片化加剧,癌干细胞比例与干性相关蛋白ABCG2与Oct4表达量升高,SP细胞比例也增加,癌干性表型上升。3.Drp1的活性抑制剂Mdivi-1干预CNE1与CNE2细胞后,线粒体的分裂显著抑制,癌干性蛋白表达降低,SP细胞比例下降,克隆形成减少。敲低Drp1后,CNE1与CNE2中由于COX-2高表达后引起的碎片化被显著抑制,CNE1与CNE2细胞中COX-2高表达后引起的SP比例升高与克隆形成增多也被逆转。4.COX-2敲低表达后,与shCtrl相比,COX-2低表达细胞中线粒体定位的COX-2减少,线粒体碎片化减少,同步检测癌干性相关蛋白ABCG2与Oct4,与shCtrl相比,表达量降低,SP细胞比例也降低,癌干性表型下调。5.采用RSV抑制Mito-COX-2的表达后,抑制CNE1与CNE2细胞COX-2与p53的线粒体定位,减少线粒体碎片化计数,RSV降低鼻咽癌细胞中COX-2、ABCG2与Oct4的蛋白表达、SP细胞的比例与细胞克隆形成,下调癌干性表型。6.化疗药物5-FU诱导CNE1与CNE2细胞COX-2表达量升高,线粒体定位的COX-2与p53增加,线粒体碎片化计数上升,诱导NPC干性上调。RSV抑制5-FU诱导CNE1和CNE2细胞的NPC干性上调,增加5-FU对CNE1与CNE2细胞生长活力的抑制,增加5-FU对NPC移植瘤生长的抑制作用,增强NPC对化疗药物的敏感性。结论:COX-2在线粒体的分布通过诱导p53的线粒体转位参与Drp1诱导活化,导致线粒体分裂增强和介导NPC细胞干性上调;线粒体COX-2的靶向干预能抑制NPC细胞干性表型和增强化疗药物的敏感性;阐释了线粒体COX-2与p53转录非依赖途径调节线粒体质量控制的分子机制,提示线粒体COX-2作为癌干性干预的分子标志和增强抗肿瘤敏感性的潜在分子靶点,为人群致癌作用的化学预防和靶向干预策略提供了科学依据。