葡萄糖异构酶是一种重要的工业用酶,可以将D-葡萄糖和D-木糖分别转化为D-果糖和D-木酮糖,已应用于高果糖浆的工业化生产中。目前国内生产高果糖浆的企业,仍然依赖国外商业化生产的葡萄糖异构酶,由于商业化的葡萄糖异构酶最适反应温度一般在60℃左右,催化葡萄糖生产果糖的转化率仅为42-45%,为了获取市场需求量较大的55%的高果糖浆还需要色谱分离技术,成本较高。因此本论文通过基因挖掘技术筛选葡萄糖异构酶的基因,首先以Thermotoga neapolitana DSM 5068 和 的葡萄糖异构酶的氨基酸序列为模板,在NCBI中进行Blast分析,选取了来自Thermotoga petrophila RKU-1(TPGI)和 Thermoanaerobacter ethanolicus CCSDl(TEGI)的葡萄糖异构酶基因,并对其进行密码子优化,基因合成,分别获得1332 bp和1314 bp的tpgi和tegi基因,分别将基因插入大肠杆菌表达载体pET-28b(+)中,构建到了重组表达质粒pET-28b-TPGI和pET-28b-TEGI,将其分别转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主,构建了两株重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TPGI和E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TEGI,经过发酵培养和IPTG诱导实现了 TPGI和TEGI的异源表达。SDS-PAGE分析发现,TPGI和TEGI的分子量约为50 kDa。酶活力测定结果表明,TPGI的酶活力达到181 U/g(WCW),TEGI 的酶活力为 195 U/g(WCW)。利用Ni-NAT柱亲和层析对E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TPGI和E.coli.BL21(DE3)/pET-28b-TEGI 表达的 TPGI 和 TEGI 分别蛋白分离纯化,经SDS-PAGE验证得到电泳纯的TPGI和TEGI;并以D-葡萄糖为底物,分别对TPGI和TEGI进行酶学性质分析。结果表明,TPGI和TEGI的最适催化温度分别为85℃和90℃,最适催化pH分别为7.0和6.5。TPGI和TEGI均具有较好的热稳定性,TEGI能够在最适温度90℃下保温9 h后,仍保留60%以上的酶活;TPGI在最适温度85℃保温1 h后,仍保留80%的酶活。TPGI和TEGI均是金属离子依赖型酶,Co2+对酶活力及其稳定性起着重要作用,添加1 mM Co2+和15 mM Mg2+可使酶活力达到最大;而Ni2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+和Ca2+对酶活有一定抑制作用,Ca2+浓度在18 mM左右时,酶活力损失接近50%;Ca2+浓度较低时对TEGI酶活力抑制作用相比TPGI要低。TPGI和TEGI对D-葡萄糖的Km分别373 mM和421 mM,Vmax分别为13.4U/mg,27U/mg;对D-果糖的Km分别为897mM和487mM,Vmax分别为38.1 U/mg,15.6 U/mg。葡萄糖为 10%(m/v)时,TPGI 和 TEGI 催化底物的转化率均能达到53%。而葡萄糖浓度为20%和30%时,TEGI催化底物的转化率分别为42%和38%;而TPGI仅为30%和21%。综合比较,选择E.coli BL21(DE3)/pET28b-TEGI为生产菌株做进一步产酶条件优化研究。结果表明,最适培养条件为:种子培养时间为10 h,最适发酵培养基为甘油培养基(蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,甘油20 mL,pH 7.0),最适初始发酵pH为7.0,发酵培养基中Co2+的添加浓度为0.4 mM,以0.15 mMIPTG为诱导剂,诱导时机为37℃培养3-4h,诱导时间为12h,诱导期最适培养温度为25℃。优化后最终生物量达到11.05 g/L(WCW),是优化前的2倍;酶活力为228 U/g(WCW),比优化前提高了 12%。