抗体作为免疫检测技术开发的关键原料,其质量直接决定了相应免疫检测方法的性能。对于一些免疫原性低,甚至不具备免疫原性的目标检测物,传统的免疫方式较难以获得高质量的目标抗体。同时在免疫检测过程中,抗原与抗体间的亲和力对所建立的检测方法灵敏度的影响也是不可忽视的。因此,开发高质量检测抗体及明确抗原与抗体间的亲和力对免疫检测方法灵敏度的影响十分有意义。本研究通过应用细胞因子作为分子佐剂辅助免疫制备单克隆抗体,在DNA免疫和皮下免疫两种免疫策略中证实了细胞因子作为分子佐剂对制备单克隆抗体的积极效果。进一步分析了高亲和力抗体所识别的具体抗原表位信息,以及抗原表位氨基酸对抗原-抗体免疫反应亲和力的影响,明确了亲和力在抗原与抗体结合与解离反应过程中的重要作用。通过分析系列与检测抗体具有不同亲和力的竞争抗原对竞争法免疫检测灵敏度的影响,明确了竞争抗原与检测抗体的亲和力和样本中待检抗原与检测抗体的亲和力差异对竞争法免疫检测灵敏度的影响。最后,应用制备得到的高亲和力单克隆抗体开发了抗缪勒氏管激素（Anti-mullerian hormone,AMH）及和肽素（Copeptin,CPP）全自动化学发光检测试剂（Chemiluminescence immuneassay,CLIA）,试剂具有优异的使用性能,并可用于临床样本的检测。主要研究结果如下:（1）通过将合成得到的mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20基因片段连接到载体pCAGGS上,成功构建重组载体pCAGGS-mFlt3L,pCAGGS-mGM-CSF及pCAGGS-mCCL20。并验证了其可在293F细胞中有效表达目标蛋白,表明可作为分子佐剂进一步实验。（2）利用分子佐剂（mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20）辅助DNA免疫的策略成功制备了针对AMH的高亲和力抗体,使用K_D值小于4 nM的两株高亲和力单克隆抗体成功构建了AMH化学发光检测方法。该分析方法对AMH检测表现出高度敏感性和特异性。检测范围为0.125²0 ng mL^-1,检出限为0.099 ng mL^-1。孵育时间仅需30 min,而商品ELISA试剂盒需3 h。用于临床血清标本中AMH的检测,结果与标准AMH检测ELISA试剂盒具有高度一致性。（3）通过分子佐剂（mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20）辅助皮下免疫后,杂交瘤的阳性率明显提高,且经过一次杂交瘤制备、亚克隆筛选便得到8株稳定分泌抗体的细胞株,对比皮下普免两次杂交瘤制备得到4株的得率,此策略明显提高抗体的开发效率。经过纯度和效价检测,所制备的抗体纯度均可达到90%,效价均大于1:10⁵;经过细胞免疫化学实验确认,所制备的抗体可与天然的和肽素发生特异性反应,具备免疫检测试剂开发的要求。通过亲和力表征对比,发现分子佐剂辅助免疫制备的抗体亲和力远高于皮下普免制备的抗体,最高亲和力抗体的K_D值可达10^-1010 M。（4）经过生物信息学软件分析及肽扫描,最终确定了4株高亲和抗体的表位序列,均位于152¹61（APEPFEPAQP）。经过丙氨酸突变扫描和分子动力学分析,发现4株抗体的表位关键氨基酸主要为脯氨酸（P）、苯丙氨酸（F）和谷氨酰胺（Q）。最终明确抗原氨基酸序列中含疏水氨基酸较多的位置容易形成抗原表位。（5）通过在免疫层析和间接竞争ELISA检测体系同时研究竞争抗原与检测抗体间的亲和力变化对检测体系灵敏度的影响,发现适度下调竞争抗原与抗体的亲和力后,检测限（Limit of detection,LOD）显著下降,在免疫层析体系中最高下降至原LOD的9.5%,在间接竞争ELISA体系中最高下降至原LOD的12.1%,最佳灵敏度改善效果LOD低至0.09 nmol L^-1。表明适度的降低竞争抗原与检测抗体之间的亲和力可以改善竞争免疫检测方法学的灵敏度。（6）选用抗CPP高亲和力抗体作为捕获抗体,磁珠作为固相载体,成功构建了可用于CPP检测的全自动CLIA,检测范围1.2¹250 pmol L^-1,且最低检出限LOD仅为6.25 pmol L^-1,完全满足临床应用需求(<18.9 pmol L^-1)。再者,全自动CLIA的样本孵育时间仅为30 min,而对照ELISA则需要2 h以上。用于临床血清标本中的CPP检测,与市售CPP检测ELISA试剂盒相比,结果具有显著一致性。因此,所构建的全自动CLIA分析方法可以成功用于CPP的临床快速检测。