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【研究背景及目的】随着人们生活水平的不断提高,动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）性心血管疾病的发病率和病死率逐年升高,已严重威胁着人类的生命健康,给家庭和社会带来巨大负担。AS是以动脉血管壁脂质沉积、内膜损伤增生、炎性浸润和粥样斑块形成为主要病理表现的病变,其发病机制非常复杂,受多种因素综合影响,国际学术界为此提出了众多AS发病机制学说,其中脂质浸润学说、氧化应激学说、炎症学说仍是当今主要研究的热点。脂质浸润学说认为血液中增多的氧化低密度脂蛋白侵入受损的血管内皮细胞并蓄积在内皮下,使单核细胞粘附在内皮细胞上的数量增多,并向内膜下迁移转化为巨噬细胞,通过清道夫受体吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫细胞。当巨噬细胞不能有效降解脂蛋白,它们将体积变大甚至破裂,导致大量的氧化脂蛋白进入血管壁,加剧AS的发生发展。因此巨噬细胞功能的改善在AS形成中起重要作用,但目前对改善巨噬细胞功能方面的研究所知甚少。研究发现,氧化应激存在于AS发生发展过程中,并介导了单核巨噬细胞功能改变和损伤,而减轻巨噬细胞氧化损伤可能有助于延缓AS的进程。因此如何提高巨噬细胞的抗氧化能力具有重要意义。白藜芦醇（Resveratrol,Res）是红葡萄酒中发挥心血管保护作用的重要物质,其具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集和抗血栓形成等多种生物活性,其中Res抗氧化和抗炎方面的作用最为突出。但是其是否对巨噬细胞具有保护作用尚不明确。众所周知,内皮细胞和平滑肌细胞也是AS形成的重要细胞组成,有研究发现Res可以通过提高内皮细胞及平滑肌细胞的抗氧化能力起到细胞保护作用,从而延缓动脉粥样硬化形成,因此,我们推测Res对巨噬细胞氧化损伤也具有保护作用,可以改善巨噬细胞功能,延缓AS进展。为此,本课题拟观察Res预处理THP-1源性巨噬细胞后能否改善对THP-1源性巨噬细胞的氧化损伤。另外,鉴于自噬是细胞自我保护的重要机制,巨噬细胞自噬在动脉粥样硬化中发挥了自我保护的作用,在本研究中也将进一步探讨Res的作用效应及与巨噬细胞自噬之间的可能的联系。【方法】1.佛波酯诱导人单核THP-1细胞分化为巨噬细胞每次实验前,将处于对数生长期的人单核THP-1细胞用160 nmol/L的佛波酯（PMA）孵育48h,诱导后分化为巨噬细胞,利用倒置显微镜下动态观察细胞的形态学变化。用免疫细胞化学的方法进一步鉴定巨噬细胞。2.巨噬细胞氧化损伤模型的建立将巨噬细胞分为对照组（Control组）、不同浓度过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）处理组:分别加入浓度100、200、300、400、500μmol/L H2O2作用细胞12h、24h、36h。MTT法检测各组巨噬细胞的细胞活力,确定H202最佳诱导损伤的浓度及作用时间,建立巨噬细胞氧化损伤模型。3.不同浓度Res对氧化损伤巨噬细胞的干预作用将巨噬细胞分为Control组、H2O2组、H2O2+Res组:分别加入20、40、60、80、100μmol/L Res预处理1 h,随后加入300μmol/L的H2O2处理24 h,MTT法检测巨噬细胞活力。确定Res最佳保护巨噬细胞的浓度,作为后续实验的作用浓度。4.Res对氧化损伤巨噬细胞后抗氧化及抗炎能力的作用将巨噬细胞分为Control组、H2O2组、H2O2+Res组,进行抗氧化能力相关指标检测:超氧化物歧化酶（SOD）的活力检测,丙二醛（MDA）含量检测;抗炎能力相关指标检测:ELISA检测巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达。5.研究白藜芦醇对巨噬细胞氧化损伤模型组自噬活性的影响将巨噬细胞分为Control组、H2O2组、Res+H2O2组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）+Res+H2O2组:5mmol/L 3-MA预处理30分钟,后加入白藜芦醇处理1小时,最后H2O2作用24小时。Western blot法检测LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin-1蛋白的表达水平。【结果】1.THP-1细胞成功诱导分化为巨噬细胞人单核THP-1细胞160 nmol/L的佛波酯（PMA）孵育48h,成功诱导后分化为巨噬细胞。2.氧化损伤模型的建立随着H2O2处理的浓度的升高和时间延长,巨噬细胞活力逐渐下降,其中采取300μmol/L H2O2处理24h后,细胞损伤明显,且细胞存活率稳定于50%以上、作用时间适中,适于建立巨噬细胞的氧化性损伤模型。3.筛选出Res对氧化损伤巨噬细胞的最佳保护作用浓度相比Control组,H2O2组巨噬细胞活力明显下降;相比H2O2组,给予不同浓度Res预处理的巨噬细胞活力明显升高,40μmol/L Res对巨噬细胞的保护作用效果最佳。4.Res可以提高氧化损伤巨噬细胞的抗氧化及抗炎的能力相比Control组,H2O2组巨噬细胞SOD活力性显著下降,MDA含量明显增多;相比H2O2组,Res组巨噬细胞MDA含量明显下降SOD活力性显著升高,MDA含量明显减少。相比Control组,H2O2组巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达均明显有所增多;而相比H2O2组,Res组巨噬细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α表达均明显有所下降。5.Res可能通过自噬途径改善巨噬细胞抗氧化及抗炎能力相比Control组,H2O2组巨噬细胞LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值和Beclin1蛋白表达明显降低;相比H2O2组,Res+H2O2组LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值和Beclin 1蛋白表达明显降低;相比Res+H2O2组,3-MA+Res+H2O2组LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值和Beclin 1蛋白表达明显降低。【结论】Res对氧化损伤的巨噬细胞具有保护作用,可提高巨噬细胞的抗氧化及抗炎能力,并能上调氧化损伤巨噬细胞自噬相关蛋白,因此我们得出最终的结论:Res可提高巨噬细胞部分抗氧化及抗炎能力,其机制可能是部分上调细胞自噬蛋白表达,通过调节自噬途径实现的。