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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)作为危害养禽业发展的一种急性传染性疾病,迄今为止波及全球一百多个国家,造成了巨大的经济损失。同时,NDV作为溶瘤病毒的研究也有50多年的历史,具有安全性(对人基本无害)、特异性(能杀伤多种癌细胞且对正常细胞影响较小)、可操作性(能够通过反向遗传技术重组病毒)的特点,成为了溶瘤疗法研究中的热点。结肠癌作为全球最常见的恶性肿瘤之一,目前主要的治疗方案是进行手术切除,辅以化学治疗和放射疗法。应用阿霉素(Doxorubicin/Adriamycin)对结肠癌进行化疗时,取得了良好的限制肿瘤发展和转移的效果,但是也滋生了癌细胞针对阿霉素的耐药现象。如果能够研发一种新型的治疗方案,对耐药性癌细胞也起到良好的特异性杀伤效果,再与现有的治疗手段相结合,势必会取得更好的治疗结肠癌效果。本文通过对多株NDV毒株进行溶瘤能力筛选,确定了一株能够对A549(肺癌细胞)和Lo Vo(结肠癌细胞)溶瘤且呈时间依赖性的NDV SH15株,侧面证明了NDV的溶瘤能力具有毒株特异性。生物学试验结果显示SH15株的MDT为67 h,ICPI为1.6属于中毒毒力毒株。全基因组测定结果表明SH15株的基因组全长为15 186bp,登录号为KY247177,属于ClassⅡ分支中基因Ⅲ型,推测HN蛋白上H203位点可能是其溶瘤活性的一个潜在关键点。采用Lo Vo和Lo Vo/Adr(耐阿霉素结肠癌细胞),在SH15株感染后的不同时间点收集细胞样品或培养液上清,通过镜下拍照观察细胞病变、CCK-8检测细胞活性、绘制病毒多步生长曲线、IFA试验观察病毒复制情况,再用Hochest33258染色、TUNEL、Western Blot检测PARP、Caspase-3、NP、Caspase-8、Caspase-9以及FCM检测Annexin V-FITC/PI染色鉴定细胞凋亡,最后通过实时荧光定量PCR法检测TNF-α、IFN-β以及下游的MX1、IFIT3、OAS的表达情况,以及ELISA检测相应的蛋白含量变化,尝试从细胞凋亡信号通路、IFN通路及TNF信号通路方面多角度入手,评估SH15株对于耐药性细胞的溶瘤能力,以期能够发现SH15株的对Lo Vo及Lo Vo/Adr的溶瘤特性以及阐述其溶瘤机制,为今后以NDV为载体开发肿瘤靶向药物奠定基础。结果如下:1.SH15株能够有效杀伤Lo Vo和Lo Vo/Adr,并且对后者的杀伤效果更为明显。Lo Vo/Adr感染第18 h后,镜下只有零星的贴壁细胞,而Lo Vo仍有一半细胞存活;感染后第30 h,Lo Vo/Adr已经全部处于飘浮状态,而Lo Vo视野中还有四分之一的细胞贴壁。CCK-8检测结果显示感染病毒后第36 h,Lo Vo活性降到了63.1%,而Lo Vo/Adr活性则降到42.7%。多步生存曲线显示SH15株在两种细胞中的复制速率最高时相差近十倍(感染后第36 h)。得出结论,SH15株差异性诱导不同结肠癌细胞的溶瘤作用与病毒的复制速率不同有关。2.SH15株主要通过凋亡通路途径诱导Lo Vo和Lo Vo/Adr死亡,且Lo Vo以外源性凋亡途径(Caspase-8)为主,而Lo Vo/Adr则内源性外源性凋亡途径(Caspase-8、-9)都有参与。Western Blot检测自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62),发现在两种细胞感染SH15株后,并没有发生明显的上调。而Annexin V-FITC/PI染色证实,坏死并非造成两种细胞死亡的主要原因。而PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等蛋白在病毒感染后出现了裂解失活或激活现象。3.Lo Vo和Lo Vo/Adr感染病毒后TNF-α的表达水平的差异性是造成两种细胞死亡程度不一致的主要原因,Lo Vo/Adr中TNF-α大量生成造成了细胞的快速死亡。Lo Vo/Adr感染病毒后的第6 h,TNF-α的mRNA水平就明显高出Lo Vo 3倍不止(随后的12、18 h也是高出1倍有余),在第24 h后才开始低于Lo Vo。而TNF-α蛋白水平方面,Lo Vo/Adr则是一直高于Lo Vo且随时间推移由高出6倍到后的几百倍最后高达600多倍。结合TNF-α的mRNA水平和蛋白水平结果,表明Lo Vo/Adr感染病毒后生成TNF-α因子显著高于Lo Vo。4.SH15株能够诱导Lo Vo和Lo Vo/Adr产生抗病毒反应,但是Lo Vo的抗病毒反应更为明显,而Lo Vo/Adr则偏弱。抗病毒反应的程度不同造成的病毒在不同细胞中的复制速率的不同。5.Lo Vo/Adr上的IFN-β识别环节可能存在缺陷,造成胞内合成的IFN-β持续在胞外堆积使得IFN-β信号通路后期受阻,最终影响了Lo Vo/Adr的抗病毒能力。