桑树是一种药食两用的植物,桑枝是蚕桑生产中的最大废弃物。桑皮提取物或粉末在体内和体外都具有明显降血糖的作用。蚕丝加工废弃物中回收的丝胶蛋白也被证实具有抗紫外活性、抗氧化、清除自由基和抑制α-糖苷酶等多种生物活性。银杏白果因具有多种生物活性功能,也是人们常常食用的一种健康食品。为了开发一种具有辅助降血糖、抗氧化等多种功能的健康食品如大众喜爱的高糖食物一面包,让糖尿病人或糖尿病前期人群既可饱腹,又不至于因食用高碳水化合物食品使血糖升高过快,甚至可以降低血糖水平。本实验研制了一种含有桑皮粉、丝胶粉和白果粉等多元成份的混合面包,食用1月后对2型糖尿病小鼠的生理生化、抗氧化功能、脂质代谢和糖代谢等相关代谢通路与炎症反应等以下几方面作了研究和探讨。通过感官要求可以得出单一丝胶和白果面包得分比混合三元成分面包的高,说明口感和品质较佳,但是混合三元成分面包综合感官稍差。体外分析结果表明,三元混合面包具有很强的自由基清除能力,IC50分别为2.85±3.24 mg/mL和156.31±9.31 μg/mL。也有很强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性(IC50为0.31±2.94 mg/mL),以上结果说明这种多元混合面包具有一定的生物活性。利用高脂高糖饲料喂食和一次性腹腔注射STZ(90 mg/kg·BW)诱导2型糖尿病小鼠模型(T2DM),分为模型组,丝胶粉、白果粉的单一成分面包组,低剂量、中剂量和高剂量的丝胶粉、白果粉和桑皮粉的三元成分面包组。实验结果表明,丝胶组小鼠血糖最终血糖趋近于正常组血糖值(8.83 mmol/L)。三个低、中、高剂量三元混合组小鼠血糖水平总体上呈下降趋势,也具有一定的剂量效应。高剂量组小鼠血糖从最初的13.59±3.01 mmol/L降低到9.26±1.59 mmol/L,降糖率为31.84%,明显缓解了糖尿病小鼠的高血糖状态。三元混合面包组和单一组分面包组小鼠血清胰岛素水平与模型组相比都有明显下降,其中高剂量三元混合面包组下降率(53.26%)显著高于单一成分丝胶和白果面包组(43.41%和40.72%)。这充分说明这些混合成分面包添食明显消除了 2型糖尿病小鼠的胰岛素抵抗现象。丝胶面包组和白果面包组小鼠体重虽然也是呈现出先降低后增长的趋势,但是最后平均体重均未达到最初小鼠的平均体重,三元混合面包组的小鼠体重也出现先减轻后缓慢增长的趋势,但高、中、低三个剂量组小鼠最终体重基本上都高于最初体重,高剂量组小鼠最后体重最高达到40.69±2.86 g。在第24天进行的口服糖耐量实验(OGTT)和胰岛素耐量实验(ITT)都证实三元成分混合面包组还是单一成分面包组(丝胶面包组和白果面包组)或多或少缓解了2型糖尿病小鼠的糖耐量异常和胰岛素抵抗现象。实验结束后,解剖小鼠眼球取血、取肝、肾和胰完成生理生化各项指标测定,病理组织切片观察和蛋白测定。实验结果表明,这五种面包添食还降低了 T2DM小鼠异常升高的糖化血清蛋白和血清肝功能酶活性(AST和ALT),降低模型小鼠的TG和LDL-C水平和升高其HDL-C水平,说明调节了 2型糖尿病小鼠的血脂代谢。实验结果还表明,这五种混合面包的添食还可以增加糖尿病小鼠的抗氧化能力。2型糖尿病小鼠T-SOD水平严重受损,下降到89.00±1.41 U/mgprot,是正常小鼠组水平的78%。而单一成分的丝胶面包组和白果面包组肝脏内T-SOD 水平基本等同于超过了正常小鼠组水平,最高剂量的三元混合面包组含量高达121.99±15.71 U/mgprot,甚至高于正常小鼠水平7%;CAT变化趋势与T-SOD非常相似,与正常组相比,模型组CAT水平显著下降到83.65%,而五个处理组无论是添加单一成分还是三元成分,CAT水平都显著回升,都超过正常小鼠水平。丝胶和白果面包组CAT水平分别超过正常组1.76%和11.4%,三元混合组水平都远远高于正常组,呈剂量效应,高剂量组达到303.86±37.35 U/mgprot,超过正常组的13.37%。MDA情况也基本相似,模型组水平显著高于正常组37.24%,食用丝胶面包和白果面包后其MDA水平分别下降到模型组80.4%和75.38%,高、中剂量的三元混合组也显著下降到模型组水平69.85-86.42%。另外,五个样品组面包食用后其8-OHdG水平的下降与模型组相比大都也具有统计学意义(P<0.05,P<0.001)。同时,肝脏病理组织切片观察到两个单一组分面包组肝脏组织虽然较模型组有改善,但是仍有轻微炎症发生,而混合组分组小鼠肝脏细胞排列紧密,炎症情况明显减少,以上肝脏部分的实验结果充分说明混合面包的添食可以显著减轻机体的氧化应激反应,对肝脏有明显的保护作用。为了加深研究多元成份混合面包提高抗氧化能力、调节血糖水平以及降低炎症因子等作用机理,本实验通过蛋白免疫印迹法(WB)探讨其对T2DM小鼠肝脏胰岛素信号通路、糖代谢、脂肪代谢和炎症反应的影响。实验结果表明,无论是丝胶、白果面包还是桑皮粉末、丝胶、白果三组分混合面包的添食,都可以明显地升高糖2型尿病模型组小鼠肝脏内胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物(IRS-1)水平,通过激活受损的PI3K/AKT/AMPK通路,使得磷酸化失活,增加GS活性,下调G6pase和PCK水平,增强糖原合成和抑制糖异生作用;激活GLUT4转位,加速葡萄糖利用;激活的AMPK使与糖酵解有关的酶表达水平增加,加速糖酵解的发生;活化的AMPK还可以抑制ACC产生,从而抑制脂肪合成。另外,与炎症相关的几种因子的表达下降也说明减轻了体内的炎症反应。另外,测定胰脏病理组织切片和免疫荧光染色,病理组织切片结果表明丝胶组和白果组小鼠胰腺组织相比模型组有一定的改善,结构相对完整;其它三个混合剂量组与模型组相比有较大改善,与单一组分面包组比较细胞数目增多,分布均匀紧密,结构更加完整,呈现一定的剂量效应,说明胰岛损坏程度被大大改善。免疫荧光染色结果表明,丝胶组表现较强的绿色荧光,胰岛素分泌增加,说明通过丝胶面包的添食使得胰岛β细胞数量变多,功能正常,单一白果组也有绿色荧光,但是效果不明显。最后通过三个混合剂量面包的添加,胰岛内绿色荧光强度逐渐变强,胰岛结果也不断完整,说明胰岛β细胞数量变多,并且表现出一定的剂量效应。糖尿病小鼠肾脏内的T-SOD、T-AOC和GSH-PX水平分别显著低于正常小鼠18.19%、26.77%和29.65%,食用五种混合组分面包后与模型组相比,这三种抗氧化指标都有明显回升,其指标都接近或超过正常组水平,侃三元混合面包的高、中、低剂量效应不够明显。与肾脏损伤相关因子的表达来看,单一组分组小鼠肾脏内炎症减少,TNF-α低于模型组,白果面包组和中剂量三元面包组小鼠肾脏的TNF-α显著降低(P<0.05)。最高剂量的三元混合面包组MCP-1含量相比于模型组有显著降低(P<0.01),达到61.26±0.02 pg/mL;模型组小鼠肾脏内p-P38α水平显著高于正常组小鼠(P<0.05),添食五种面包后,各组水平都呈下降趋势,中、高剂量的三元混合面包组下降明显(P<0.05),最高剂量面包组达到14.96±0.03 pg/gprot,几乎接近于正常组水平。以上这些肾脏组织的抗氧化结果和病理切片的观察都同时证实五种混合面包添食都能增加小鼠肾脏抗氧化能力和减轻肾损伤。综上所述,三组分混合面包和单组分面包的添食都不同程度地降低了 2型糖尿病小鼠的血糖水平,增强糖尿病小鼠机体的抗氧化能力,改善胰岛素抵抗,能够调节糖代谢和脂代谢,还能改善肝肾损伤,保护胰岛细胞。本实验主要是利用蚕桑生产中大量的废弃物或副产物桑皮粉末和丝胶蛋白粉末等开发高附加值的多组分混合面包,不仅使糖尿病患者或糖尿病前期人群能够吃饱,也能对糖尿病降低血糖水平具有辅助疗效和开发功能性健康食品具有潜在的应用和开发价值,也会对栽桑养蚕农民提高收入、蚕丝业废弃物的综合利用、蚕桑产业的可持续发展呈现出新的希望。