目的:建立超高液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）检测比格犬血浆中泽布替尼的方法,观察单独服用泽布替尼与同时服用康莱特和泽布替尼后,泽布替尼在比格犬体内的代谢改变情况。由于泽布替尼主要由CYP3A4酶进行代谢所以同时在体内外通过Western Blot（WB）实验观察康莱特对CYP3A4酶蛋白表达的影响间接判断其活性,从而与体内康莱特对泽布替尼代谢的影响结果相比较来验证体内外实验结果是否相一致,最终为合理的联合用药提供参考。方法:康莱特对泽布替尼代谢影响的体内实验:两组比格犬（12 kg±20g）雌雄各半,每组6只随机分配。A组（泽布替尼加生理盐水）、B组（泽布替尼加康莱特）。根据比格犬体重灌胃生理盐水、康莱特（90 mg/kg）30分钟后,分别给予泽布替尼（5 mg/kg）。给药之后在规定的时间点采血以获取血浆样本。采用乙腈蛋白沉淀法处理血浆样本,以Ibrutinib作为内标（IS）,色谱柱是ACQUITY UPLC BEH C18 Column（1.7-μm,2.1×50mm）,0.1%甲酸和乙腈组成流动相,并设定梯度洗脱程序。质谱检测采用正离子条件下,扫描方式为多反应离子检测模式,应用药物和统计（DAS）2.0软件计算泽布替尼的药代动力学参数。康莱特对培养的肝细胞中CYP3A4酶生成量影响的体外实验:比格犬（12kg）首先进行肝细胞的分离,制备比格犬原代肝细胞。比格犬禁食8h后小隐静脉注射3%戊巴比妥钠（30mg/kg即1ml/kg）将比格犬麻醉。然后,经股静脉注射肝素200 IU/kg,用70%乙醇擦洗比格犬腹侧面略偏左侧位置,打开腹腔后门静脉插管固定,快速灌注无钙HEPES缓冲液,第二步灌流为含0.05%胶原酶的HEPES缓冲灌流液至肝脏变白变软,摘下肝脏,用适量L-15 Leibovitz培养液分散细胞于DMEM培养基重悬,用0.4%台盼蓝检测细胞活力保证细胞活力大于85%,调整细胞浓度为4×10~5cells/ml。其次用三明治法对制备的比格犬肝细胞进行培养最后用Western blot法检测空白对照组及低,中,高不同浓度康莱特组比格犬肝细胞的CYP3A4酶蛋白相对表达量。康莱特对肝脏组织中CYP3A4酶生成量影响的体内实验:30只SD雄性大鼠（300g±10 g）随机分成5组:空白对照组（生理盐水）,L组低浓度组（120mg/kg）,M组中浓度组（240mg/kg）,H组高浓度组（480mg/kg）以及阳性对照组（利福平60mg/kg）其中M组对应康莱特临床给药剂量,根据大鼠体重分别灌胃给药连续给药三天后将大鼠处死,摘除大鼠肝脏剪碎后液氮保存。称取保存的肝脏组织进行蛋白质的提取,然后进行Western blot实验对CYP3A4酶含量进行相对性定量以观察反应趋势。结果:（1）体内结果显示,泽布替尼与康莱特同时使用后,泽布替尼的药代动力学参数发生了显著变化,可能影响泽布替尼在比格犬体内的消除行为。B组的泽布替尼的Cmax,AUC0-t和AUC0-∞分别比A组低20.65%,34.31%和34.45%。实验组的T max缩短,CLz/F也明显增加。这些结果表明,在比格犬体内康莱特对泽布替尼的药代动力学具有明显的促进作用,并减少了泽布替尼的血浆暴露量。同时体内Western blot实验显示低剂量及中剂量康莱特可促进CYP3A4酶的生成但高剂量的康莱特抑制CYP3A4酶的生成,其中低中浓度组及利福平组分别是阴性对照组的2.031,1.705和3.48倍,高浓度组是阴性对照组的0.676倍;低中浓度组康莱特对CYP3A4酶蛋白表达的促进作用分别为阳性对照利福平组的58.3%和48.9%。（2）体外结果显示,康莱特可促进CYP3A4酶蛋白质的生成。低,中,高浓度实验组与对照组相比细胞CYP3A4蛋白生成量分别是对照组的2.891,2.065和1.785倍。从体外结果可以看出康莱特可促进CYP3A4酶蛋白的生成但是随浓度的增加促进作用呈减弱的趋势。结论:1.本实验成功建立了用UPLC-MS/MS测定比格犬血浆中泽布替尼浓度的方法。该法操作简单、检测速度快、有很强特异性,回收率高,方法学验证的各项指标也都满足药代动力学指导原则中有关生物含量测定的要求,为泽布替尼的药代动力学研究提供了稳定、可靠、方便的检测方法。可用于协助药物开发和临床联合用药进行剂量调整。2.康莱特低中浓度可促进CYP3A4酶的生成,高浓度抑制CYP3A4酶的生成;临床剂量的康莱特与泽布替尼联合用药后泽布替尼的代谢加快,峰浓度和药时曲线下面积均降低。3.本课题为康莱特与泽布替尼或其他经CYP3A4酶代谢的药物联合应用时进行剂量调整提供了药代动力学参考。