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目的帕金森氏病(Parkinson disease, PD)是一种发生于中老年黑质多巴胺能神经元和黑质纹状体通路的中枢神经系统退行性疾病,以静止性震颤、肌肉强直、运动减少、运动迟缓和姿体平衡障碍为主要临床特征。现在临床多采用左旋多巴替代内源性多巴胺(Dopamine, DA)的缺乏,可改善PD症状,但大多数病人服药一段时间后疗效减退,出现运动障碍、智力减退和精神症状等副作用。同时近年研究认为PD发病与由自由基生成增多而自由基清除能力下降所引起的氧化应激致黑质多巴胺能神经元变性有关。褪黑激素是由松果体分泌的一种吲哚类激素,是一种强大的天然抗氧化剂。国内外的大量实验研究表明褪黑激素对多巴胺能神经元具有保护作用,从而缓解帕金森病症状。但是并未考虑周期性分泌的内源性褪黑激素是否对其抗氧化效应具有影响。故本研究拟在褪黑激素分泌的最高峰(23:00~2:00)和最低峰(12:00左右)分别给予小鼠外源性褪黑激素,然后对两时间点的多巴胺能神经元的作用进行对照,以探究内源性褪黑激素是否对外源性褪黑激素的多巴胺能神经保护作用有影响。实验方法1-甲基,4-苯基,1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methy4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)是一种脂溶性神经毒素,能迅速通过血脑屏障,选择性损毁黑质多巴能神经元,引起类似帕金森病的症状,为此本研究拟通过MPTP创建PD小鼠模型。选取健康成年C57BL/6小鼠60只,雄性,10-12周龄,体重20-25g,动物自由进食饮水,光照12/12 h明暗交替,室温饲养。饲养3日之后,将小鼠随机分为四组:正常对照组(5只),PD组(15只),MPTP+日间MEL实验组(简称日间组)(20只)及MPTP+夜间MEL实验组(简称夜间组)(20只)。给予PD组,日间组及夜间组所有C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP0.2ml/只,30mg·kg-,每日一次,连续7天。与此同时给予正常对照组小鼠腹腔注射无菌生理盐水0.2ml,同样每日一次,连续7天。在实验的第8天,分别于每日12:00和凌晨1:00给予日间组小鼠和夜间组小鼠腹腔注射褪黑激素0.1ml/只,10mg·kg-,每日一次,连续7天,褪黑激素先用无水乙醇溶解。与此同时给予正常对照组及MPTP对照组小鼠腹腔注射无菌生理盐水0.1ml/只,同样每日一次,连续7天。然后常规麻醉后经心脏灌流固定,取脑,制作7μm厚石蜡切片。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是脑内多巴胺合成的限速酶,故分别采用TH免疫细胞化学染色、Western blot、免疫荧光及免疫电镜等技术分析四组小鼠的黑质和纹状体多巴胺能神经元的变化情况。结果与正常对照组相比,PD组TH免疫阳性神经元数目、TH蛋白表达量、免疫荧光强度及内质网膜免疫沉积物和电子密度明显降低,而日间组没有明显变化。与PD组相比,日间组TH免疫阳性神经元数目、TH蛋白表达量、免疫荧光强度及内质网膜免疫沉积物和电子密度明显增加,但是夜间组没有明显变化。日间组和夜间组相比没有显著性差异。结论1、PD组黑质及纹状体TH免疫阳性反应,阳性细胞计数,TH蛋白表达量,TH免疫荧光强度,内质网膜免疫沉积物及电子密度明显低于正常对照组,表明MPTP对C57BL/6小鼠具有毒性作用,PD模型创建成功。2、日间组比PD组TH免疫阳性反应,阳性细胞计数,TH蛋白表达量,TH免疫荧光强度,内质网膜免疫沉积物及电子密度明显增加,提示外源性褪黑激素对多巴胺能神经元具有保护作用。3、夜间组与PD组实验结果之间没有明显差异,但各指标明显低于日间组,表明内源性褪黑激素对多巴胺的拮抗作用可能影响到外源性褪黑激素的多巴胺能神经保护作用。