【摘 要】
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钙离子(Calcium,Ca2+)作为细胞内重要的第二信使,参与调控一系列细胞生物学过程。越来越多的证据表明,Ca2+稳态失衡与肿瘤的发生和进展密切相关。因此,深入探究调控Ca2+稳态的分子机制,不仅可以提高对肿瘤病理过程的认识,还可为开发新的肿瘤治疗策略提供依据。为了精确调控Ca2+相关生物学功能,细胞形成了由多个Ca2+泵、Ca2+通道蛋白,Ca2+结合蛋白等构成的Ca2+调控系统,这些蛋白通
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（No.82025027,31871389,31741084,32000517,82030033,91754204）；
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钙离子(Calcium,Ca2+)作为细胞内重要的第二信使,参与调控一系列细胞生物学过程。越来越多的证据表明,Ca2+稳态失衡与肿瘤的发生和进展密切相关。因此,深入探究调控Ca2+稳态的分子机制,不仅可以提高对肿瘤病理过程的认识,还可为开发新的肿瘤治疗策略提供依据。为了精确调控Ca2+相关生物学功能,细胞形成了由多个Ca2+泵、Ca2+通道蛋白,Ca2+结合蛋白等构成的Ca2+调控系统,这些蛋白通过调节Ca2+进出细胞及细胞器来维持细胞Ca2+稳态,调控Ca2+信号的活化。内质网是细胞内最大的Ca2+库,多种应激因素可引起内质网Ca2+的外流,导致细胞质局部Ca2+浓度升高,进而激活Ca2+信号通路。跨膜卷曲螺旋结构域蛋白1（Transmembrane and Coiled-Coil Domains 1,TMCO1）作为一种新发现的内质网Ca2+通道蛋白,可通过诱导Ca2+外流来防止内质网中Ca2+的过度充溢,以维持内质网Ca2+稳态。TMCO1的基因突变与青光眼、颅面畸形及骨骼异常等疾病密切相关;然而,该基因是否在肿瘤中发挥作用却尚未明确;TMCO1的分子调控机制也未见报道。癌基因p53凋亡刺激蛋白的抑制因子（inhibitor of Apoptosis Stimulating Protein of p53,iASPP）在多种肿瘤中高表达,并与肿瘤耐药和转移密切相关。最初的研究表明,iASPP可在细胞核中结合p53并抑制p53的转录活性,以p53依赖的方式抑制肿瘤细胞凋亡。本实验室前期研究则发现,iASPP主要定位于细胞质,通过p53非依赖的方式稳定和激活重要的抗氧化转录因子核因子E2相关因子2（Nuclear Factor Erythroid-2 Related Factor 2,Nrf2）的活性,从而促进肿瘤的生长及耐受5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）导致的氧化应激和杀伤效应。可见,iASPP具有依赖于不同细胞定位的多种促瘤活性;然而,该基因是否参与调控Ca2+稳态却未被探究。为深入理解iASPP的促癌功能,本论文首先对iASPP过表达的转录组测序（RNA-seq）结果进行分析发现iASPP的表达与Ca2+信号通路等多条肿瘤相关信号通路相关。接下来的Ca2+流分析显示,iASPP可调控内质网Ca2+储量,iASPP过表达导致内质网Ca2+储量降低,而iASPP敲减则导致内质网Ca2+储量增加。对iASPP在肿瘤细胞中分布的研究则发现,iASPP虽然主要定位于细胞质,但其中一部分iASPP蛋白可聚集于核周。通过与内质网相关标志物的共定位分析,以及细胞亚组分分离技术发现,iASPP可定位于内质网。然而iASPP并不具有跨膜结构域,提示该基因可能通过调控其他内质网Ca2+泵或Ca2+通道蛋白发挥内质网Ca2+调控功能。的确,iASPP过表达或敲减可导致内质网定位的钙通道蛋白TMCO1蛋白表达的明显改变,并且iASPP对内质网Ca2+储量的调控活性主要依赖于钙通道蛋白TMCO1,而非其已知靶分子p53和Nrf2。在此基础上,本文进一步探究了i A SPP通过TMCO1调控钙稳态分子机制。结果表明,iASPP可抑制TMCO1泛素-蛋白酶体途径降解来提高TMCO1的蛋白稳定性,而对其m RNA表达没有明显调控作用;进而发现了E3连接酶Gp78结合和促进TMCO1泛素化降解的分子机制:TMCO1通过C-端的氨基酸序列90-188片段与Gp78的301-400片段结合,导致Gp78介导的TMCO1 K186位点发生K48位多聚泛素化修饰,进而促进TMCO1的蛋白降解。而iASPP的92-294片段能够与TMCO1的90-188片段竞争性结合Gp78,从而阻滞了Gp78介导的TMCO1泛素化降解,保护了TMCO1介导的内质网Ca2+释放功能,防止内质网中的Ca2+过度充盈,维持肿瘤细胞内质网Ca2+稳态。在揭示上述钙稳态调控机制的基础上,本文进一步探究了该机制在肿瘤生长和耐药中的作用。研究首先发现,在结直肠癌患者组织中,iASPP与TMCO1蛋白均高表达,且二者呈正相关。敲减iASPP或TMCO1明显抑制肿瘤细胞在体外培养体系中以及移植瘤在裸鼠中的生长。此外,Thapsigargin（TG）/histamine/staurosporine可明显提升iASPP/TMCO1敲低肿瘤细胞内质网Ca2+的释放和细胞质Ca2+水平,促进caspase3/7活化和肿瘤细胞凋亡。进一步的机制研究显示,该过程依赖于细胞质Ca2+信号导致的钙蛋白酶calpain活化。体内裸鼠皮下荷瘤实验进一步证实了抑制iASPP介导的TMCO1依赖性的机制,可有效促进staurosporine诱导的细胞凋亡以及肿瘤抑制效应。综上所述,本论文证实iASPP通过TMCO1来维持肿瘤细胞内质网Ca2+稳态,从而促进肿瘤的生长及对staurosporine的耐受的重要功能和机制,为靶向调控肿瘤细胞Ca2+信号的药物研发提供新思路和新线索。
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