目的：　　 获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)，由感染人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起，目前尚未研发出根治药物和有效疫苗，是一种严重的传染性疾病。高效联合抗反转录病毒治疗(Highly Active Antiretroviral Therapy，HAART)可以有效抑制HIV-1病毒复制。但在临床治疗中，部分病人发生抗病毒治疗失败，HIV-1耐药是一个极其重要的原因。由于我国HIV-1流行株和人群机体免疫状况与国外不同，因此迫切需要对我国主要HIV-1流行株耐药突变的性质及作用特点进行深入研究。　　 H221Y是近年来较受关注的一个新的反转录酶耐药突变。国内外研究发现：H221Y突变在抗病毒治疗患者中的出现频率显著于未治疗者。它经常与Y181C突变联合出现，二者间存在显著正相关性。当它与Y181C联合突变时能显著增加病毒对奈韦拉平(Nevirapine，NVP)和依曲韦林(Etravirine，ETR)的耐药水平。但对于H221Y经常与Y181C联合突变的原因在国内外研究中均未报道。有学者推测：在HIV-1病毒已经发生Y181C突变的情况下，继续应用非核苷类反转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)导致H221Y突变被选择出来。它作为补偿性突变能在一定程度上提高Y181C突变株的复制能力，以利于病毒生存，导致更高水平耐药。但到目前为止国内外均没有相关研究证明上述推测。因此，本研究选取3例B’亚型HIV-1感染者，通过纵向分析抗病毒治疗后各随访点病毒基因序列以及H221Y突变对Y181C突变株复制能力的影响，明确我国B’亚型HIV-1感染者抗病毒治疗后反转求酶Y181C突变与H221Y突变发生及演变情况，并探讨Y181C与H221Y经常联合突变的原因，从而为我国科学有效地进行抗病毒治疗以及新药研发提供理论依据。　　 方法：　　 1、研究对象　　 从我国河南地区采供血感染队列中，选择已接受抗病毒治疗且常规in-house方法进行HIV-1耐药基因型检测时检出Y181C和H221Y双突变的B’亚型HIV-1感染者3例。三例感染者于2003年初陆续开始接受免费抗病毒治疗。2003年12月至2008年1月间每半年随访一次并采集抗凝静脉血20ml，24小时内测定CD4+T淋巴细胞数，抗凝血经常规离心分离血浆，分装后-80℃冻存用于病毒载量和耐药基因变异测定。从上述血浆样本中选择治疗基线起至检出Y181C和H221Y双突变的各随访点样本用于分析。　　 2、CD4+T细胞绝对值测定　　 20μlCD4/CD8/CD3TriTEST试剂加入TruCOUNT管中，加入50μl抗疑血，室温避光15分钟，加入免洗溶血素450μl，室温避光15分钟，用FACS-MULTISET软件检测并进行自动分析。　　 3、病毒载量测定　　 利用Roche公司HIV-1 Monitor1.5 commercial kit在COBAS AMPLICOR自动病毒载量测定仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。　　 4、血浆病毒RNA提取　　 以血浆140μl，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAgen)说明书步骤提取病毒RNA，提取物溶于60μlQIAGENAVE中，-80℃冻存备用。　　 5、RNA逆转录PCR和巢式PCR　　 利用Takara One Step RNA PCR Kit，以外侧引物对：gp-1(5’-GCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAG-3’)，gp-2(5’-CCTTGCCCCTGCTTCTGTATTTCTGC-3’)，内侧引物对：gp-3(5’-TGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTG-3’)，gp-4(5-CATGTACCGGTTCTTTTAGAATCTCTCTGTT-3’)扩增1.5kbgag-pol区基因片段，该区基因编码HIV-1蛋白酶1-99位氨基酸和反转录酶1-314位氨基酸。　　 6、PCR产物纯化　　 利用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAgen)，按照试剂盒说明书纯化第二轮PCR产物。纯化的gag-pol区基因片段溶于30μl QIAGEN Elution Buffer中备用。　　 7、构建TA克隆质粒并测序　　 将纯化的gag-pol区基因片段连入pMD18-T载体中构建TA克隆质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，最终利用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAgen)提取质粒并测序，测序引物为M13F-47和M13R-48。利用Contig Express组件进行序列拼接，用BioEdit软件处理原始核苷酸序列，参照测序谱图进行基因序列修订后转换为氨基酸序列，与斯坦福大学HIV耐药数据库中参考株序列比较，确定耐药变异的位置和种类。利用MEGA4.1软件中的Neighbor-Joining方法生成系统进化树。　　 8、TA克隆质粒定点突变　　 利用QuikChange()Ⅱ XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)对Y181C和H221Y双突变的TA克隆质粒进行定点突变，将H221Y突变回野生型。两个反向互补引物为：5-CACACCAGACAAAAAACATCAGAAAGAACCTCC-3’和5’-GGAGGTTCTTTCTGATGTTTTTTGTCTGGTGTG-3’。热循环反应结束用DpnⅠ酶消化模板质粒。定点突变产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，最终提取质粒并测序以验证定点突变结果，测序引物为M13F-47和M13R-48。　　 9、构建重组HIV-1表达质粒　　 利用ApaⅠ和AgeⅠ限制性内切酶(NEB)对TA克隆质粒、定点突变质粒和pNL4-3-dE-EGFP质粒进行双酶切。用T4DNA连接酶(Invitrogen)连接酶切产物，载体与插入片段摩尔比为1:5。将T4DNA连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，最终提取重组HIV-1表达质粒并测序验证是否构建成功。测序引物为PRO-1，RT-A，RT-B，Procl-down，RT4R。　　 10、包装HIV-1假病毒　　 利用上述获得的重组HIV-1表达质粒和包膜蛋白质粒pVSV-G通过FuGENEHD转染试剂(Roche)共转染HEK293T细胞，两种质粒质量比为2:1，按照说明书步骤包装HIV-1假病毒。转染后48小时，收集假病毒上清，离心滤过后分装，用于感染实验或-80℃冻存备用。　　 11、病毒复制能力检测　　 转染48小时移去假病毒上清后，收集各孔中HEK293T细胞，用流式细胞仪检测EGFP阳性的HEK293T细胞百分比。根据单位体积中EGFP阳性的HEK293T细胞数量对用于感染实验的假病毒上清量进行标准化。取一定体积的两种假病毒上清分别感染TZM-bl靶细胞。感染后48小时，利用Luciferase Assay System(Promega)测定96孔板中每孔的荧光素酶值，病毒相对复制能力用感染细胞后待测病毒孔荧光素酶值占对照病毒孔荧光素酶值的百分比表示。　　 结果：　　 1、研究对象各随访点治疗方案及CD4+T细胞和病毒载量水平　　 本研究共获得HN224患者抗病毒治疗后4个随访点血浆样本，HN260患者3个随访点血浆样本，HN2081患者2个随访点血浆样本。三例研究对象各随访点治疗方案均为司他夫定(stavudine，d4T)+去羟肌苷(didanosine，ddI)+NVP。各随访点CD4+T细胞数在85-525个/μl之间。除3个随访点病毒载量低于检测下限值外，其余随访点病毒载量在1347-191000copies/ml之间。　　 2、抗病毒治疗后Y181C突变和H221Y突变出现及演变情况　　 成功扩增了HN224患者3个随访点，HN260患者1个随访点以及HN2081患者2个随访点病毒gag-pol区基因片段，分别命名为HN224-17.5，HN224-33，HN224-41.5，HN260-44，HN2081-26.5，HN2081-43.5。共获得57条TA克隆序列，均属B’亚型。HN224-17.5共获得9条克降序列，均无Y181C和H221Y突变；HN224-33共获得9条克隆序列，均含有Y181C和H221Y双突变；HN224-41.5共获得10条克降序列，均含有Y181C突变，其中8条同时含有H221Y突变；HN260-44共获得10条克降序列，’均含有Y181C突变，其中6条同时含有H221Y突变；HN2081-26.5共获得9条克隆序列，7条含有Y181C突变，其中2条同时含有H221Y突变；HN2081-43.5共获得10条克降序列，均含有Y181C和H221Y双突变。　　 3、H221Y突变对Y181C突变株复制能力的影响　　 各重组HIV-1表达质粒均可有效转染HEK293T细胞，转染效率在34.8％-50％之间。每组的两种假病毒中，以仅具有Y181C突变、无H221Y突变病毒作为对照病毒，携带Y181C和H221Y双突变病毒的复制能力均高于对照病毒。224病毒的复制能力是d224病毒的1.42倍，260病毒的复制能力是d260病毒的1.62倍。实验中获得的2081和d2081假病毒均无感染功能，故未能比较相对复制能力。　　 结论：　　 1.含有NVP的抗病毒方案治疗的B’亚型HIV-1感染者中，Y181C和H221Y突变是按先后顺序发生的。HIV-1病毒首先选择出Y181C突变，由于病毒复制适应性的损失，病毒进一步选择出H221Y突变。　　 2.在我国B’亚型HIV-1病毒中，当Y181C和H221Y联合突变时，H221Y突变可以提高Y181C突变株的复制能力，提高的程度可能因不同患者体内HIV-1病毒存在的其他突变不同而有差异。