晚期糖基化终末产物修饰鸡蛋卵清蛋白的致敏关联构效与免疫活性研究

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鸡蛋营养价值较高,富含多种优质蛋白,广泛应用于食品加工体系,然而鸡蛋也是联合国粮农组织统计的八大易致敏食物之一,能够引起由IgE-介导的食物过敏性疾病。其中,卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)是鸡蛋中含量最高的致敏蛋白,它在食用前常会经过不同的热处理并伴随非酶糖基化反应的发生,形成一系列可与蛋白质发生共价结合的晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)。目前关于AGEs修饰对OVA的结构、免疫原性及生理生化特性的影响尚未得到充分探讨。(1)为了探究OVA经AGEs修饰后对其理化特性、结构和抗原特性的影响,采用三种典型AGEs前体物质:甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO),乙二醛(glyoxal,GO)和丁二酮(butanedione,BU)分别模拟巴氏杀菌(65℃,30 min)和蒸煮(95℃,15 min)条件,制备不同形式AGEs修饰的OVA产物(GO-OVA,MGO-OVA,BU-OVA)。通过多种光谱、色谱、质谱、免疫信息学技术探究AGEs-OVA的结构变化、抗原性改变,并对各类AGEs的修饰位点及修饰物的种类及含量进行鉴定。结果表明,不同的前体物质修饰OVA后会得到不同的特征AGEs产物,这些产物通常是由高活性前体物质与OVA中的赖氨酸和精氨酸残基反应所得。AGEs修饰导致OVA的结构发生了不同程度的改变,主要体现在二级结构中α-螺旋含量降低,β-折叠和无规则卷曲含量升高。同时,各产物的表面疏水性降低,游离氨基和游离巯基含量下降,紫外吸收峰增大且内源性荧光强度降低,蛋白聚集分子量变大。各AGEs-OVA的IgE-结合能力下降,但却生成了含量各异的sRAGE配体,质谱结果也证实了 AGEs修饰物掩盖了OVA的部分抗原表位及生成了多种类型的AGEs产物。经相关性分析发现,产物结合IgE和sRAGE的能力与蛋白质修饰程度、(非)荧光AGEs和CML含量以及构象结构的解折叠程度有关。(2)进一步探究AGEs修饰对OVA消化特性及免疫原性的影响,利用MGO,GO和3-脱氧葡糖醛酮(3-deoxyglucosone,3-DG)三种前体在上述热加工条件下制备不同的AGEs-OVA,利用模拟胃肠消化实验研究MGO-OVA,GO-OVA和3-DG-OVA的消化特性及免疫原性改变。通过分析消化产物的亚基解离度、水解度、分子量分布探究AGEs对OVA消化速率的影响;用酶联免疫ELISA评估消化后的IgE-结合能力变化;用nano-LC-MS/MS追踪消化过程中AGEs的含量变化以及对消化后的AGEs修饰肽段做肽谱解析;最后建立肠道细胞模型(Caco-2),以q-PCR研究AGEs-OVA消化产物在肠上皮摄取过程中对细胞RAGE和炎症因子表达量的影响。结果表明AGEs修饰降低了 OVA在胃肠道阶段的消化速率,整体上产物在胃阶段的水解速率高于肠道阶段。消化的难易程度为GO-OVA>MGO-OVA>3-DG-OVA。特定的AGEs如CEL、MG-DHs对消化酶的水解有阻碍作用,主要通过阻断胰蛋白酶的酶切位点或以空间位阻效应改变蛋白酶的水解能力。AGEs-OVA消化后的多肽被Caco-2摄取吸收时,可显著上调细胞表面RAGE受体的mRNA基因表达量,且其上调水平与AGEs生成量密切相关。与对照组相比,AGEs修饰的多肽片段降低了 Caco-2细胞中IL-8的基因表达量。消化酶的水解作用破坏了 AGEs-OVA抗原表位的完整性,其致敏性均有显著降低。(3)AGEs修饰显著改变了OVA的结构和消化特性,虽在一定程度上降低了OVA及其消化物的IgE-结合能力但却显著激活了RAGE表达,这为AGEs-OVA的致敏性和生理生化改变带来了不确定因素。为了抑制食品体系中AGEs的形成,以富含花色苷、黄酮和酚酸的杨梅为研究对象,探究荸荠(BQ)、东魁(DK)、丁岙(DA)、乌紫(WZ)四种杨梅多酚抑制AGEs的形成能力及抑制机理。在OVA-MGO、牛血清蛋白(BSA)与果糖等体系中,以杨梅多酚提取物(CBEs)为抑制剂,测定反应物荧光性AGEs的水平以及糖化蛋白的羰基、巯基、β-淀粉样结构等指标;用圆二色谱、荧光光谱表征蛋白结构变化;用HPLC和UPLC-MS/MS从多角度探究CBEs抑制AGEs形成的机理。结果显示CBEs可保护蛋白质发生相关的结构修饰、聚集和交联反应。总体上各CBEs抑制能力的强弱为CBEBQ>CBEWZ≈CBEDA>CBEDK。其抑制AGEs的机理有四个方面:①清除自由基;②使过渡金属离子失活;③与蛋白质相互作用形成复合物;④捕获GO和MGO形成加合产物。
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