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正常细胞的细胞膜上胆固醇含量受到严格调控,但多种实体肿瘤(包括前列腺癌)中存在胆固醇代谢异常。胆固醇作为细胞膜脂质的主要组成成分,在细胞膜筏中大量聚集,通过与其他脂质和特定种类的筏蛋白相互作用来稳定膜结构域。胆固醇能够促进ATP5B蛋白异位到细胞膜上,并且观察到前列腺癌细胞PC-3M的迁移侵袭能力增加,而MMP-2能降解细胞外基质的基本骨架Ⅳ型胶原蛋白,破坏肿瘤细胞侵袭转移的组织学屏障,MMP-2的激活也依赖细胞膜。因此我们推测ATP5B异位表达后会影响MMP-2的作用。此外,课题组在乳腺癌细胞MDA-MB-231中通过免疫共沉淀技术得到了ATP5B-Cav-1蛋白复合物,Cav-1仅位于膜筏的小凹中,且将为支架蛋白维持其特有的内凹形态,作为膜筏标志物的Cav-1被认为是前列腺癌发展进程中的重要蛋白。因此,为了进一步明确细胞膜上ATP5B表达对前列腺癌细胞PC-3M侵袭能力的机制影响,我们采用多种促进及抑制模型,探究Cav-1、ATP5B以及MMP-2蛋白之间的关系。方法:1.提取细胞膜蛋白,利用免疫共沉淀方法,检测PC-3M细胞膜表面ATP5B、Cav-1和MMP-2的结合情况。2.在前列腺癌细胞PC-3M中,胆固醇处理0h、2h、6h、12h、24h后,提取各组细胞膜蛋白。Western blot检测负荷不同时间时,细胞膜上ATP5B、Cav-1以及MMP-2蛋白表达量。3.经PCR、Western blot技术来从RNA、蛋白水平鉴定前列腺癌中sh RNA Cav-1的沉默效果。Western blot检测Cav-1、MMP-2表达量。收集细胞上清液,明胶酶谱法检测MMP-2的合成量。并用Transwell小室来说明前列腺癌细胞PC-3M的侵袭情况。4.脂质体B04与细胞共孵育后,加入胆固醇刺激,采用Western blot检测细胞膜上ATP5B、Cav-1、MMP-2蛋白表达情况。明胶酶谱法检测细胞上清中MMP-2的分泌量。实验结果:1.前列腺癌细胞PC-3M中MMP-2与ATP5B、Cav-1共定位在细胞膜上免疫共沉淀结果显示,MMP-2抗体免疫沉淀细胞膜蛋白,得到的免疫共沉淀产物中可检测到Cav-1β以及ATP5B。2.胆固醇刺激后,细胞膜上ATP5B、Cav-1和MMP-2蛋白表达升高,且具有时间依赖性在胆固醇刺激模型中,Western blot检测负荷不同时间时细胞膜上ATP5B、Cav-1、MMP-2蛋白表达量,发现胆固醇能明显促进ATP5B的膜异位水平,且随着时间推移,在12h时ATP5B异位表达水平最高,24h稍有下降。同时,膜上Cav-1、MMP-2的表达水平随着胆固醇负荷时间的增加而增加,但作用不持久,与ATP5B蛋白表达变化趋势大体一致。3.Cav-1表达下调抑制PC-3M细胞中MMP-2表达及分泌应用shRNA抑制Cav-1在PC-3M细胞中的表达,PCR和Western blot技术手段鉴定发现,与scramble组相比后,Cav-1 sh RNA组在m RNA水平和蛋白水平表达均下调。Western blot检测到MMP-2蛋白表达下调。明胶酶谱检测scramble组与Cav-1 sh RNA组细胞上清液中MMP-2的分泌情况,发现抑制Cav-1表达之后,MMP-2分泌量下降,Transwell小室侵袭实验结果也表明PC-3M细胞在Cav-1表达下调后其侵袭能力变弱。4.ATP5B异位表达下调抑制MMP-2的分泌脂质体B04封闭胞浆ATP5B后,胆固醇刺激PC-3M细胞,促进ATP5B、MMP-2以及Cav-1的细胞膜表面表达,Western blot检测到B04封闭后,细胞膜上ATP5B的表达量明显下降,但几乎不影响MMP-2、Cav-1的表达。明胶酶谱结果显示MMP-2分泌量下降。结论:1.在前列腺癌细胞PC-3M细胞膜上MMP-2与ATP5B、Cav-1共定位。2.胆固醇刺激后,细胞膜上ATP5B、Cav-1和MMP-2蛋白表达上调,且具有时间依赖性。3.前列腺癌细胞膜小凹内ATP5B表达下调抑制MMP-2的分泌,但不影响MMP-2的蛋表达。