目的：观察环维黄杨星D (CVB-D)对缺血性心衰大鼠心功能的保护作用,明确其对急性分离大鼠心肌细胞和乳鼠心肌细胞内钙瞬变的影响,揭示药物对LTCC、 RYR2、 SERCA2a、 NCX钙循环通路相关蛋白表达及其mRNA转录水平的影响,为CVB-D临床用于缺血性心衰的治疗提供实验基础。方法：实验分为4个部分。1.利用冠脉结扎法复制心衰大鼠模型,通过超声心动图筛选心衰模型大鼠(EF≤45%),对大鼠进行分组给药,连续给药30天后,观察CVB-D对心衰大鼠一般状态、存活率、M型超声心动图参数、频谱多普勒超声心动图参数、血流动力学、左心室微循环、血浆内ANP、 AngII和ET含量、心脏质量(HM)、左心室质量(LVM)、心脏质量指数(HMI)、左心室质量指数(LVMI)、心肌组织学检查和评分、Masson染色检查心肌组织间质胶原及间质胶原体积分数(ICVF)、心肌细胞超微结构、心肌组织Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性等指标进行检查,拟明确药物对模型大鼠的保护作用,并获取量效关系。2.同上部分进行缺血性心衰大鼠模型复制、分组及给药,给药30天后对缺血性心衰大鼠心肌细胞进行急性分离,利用激光共聚焦显微技术观察电刺激下心肌细胞的钙瞬变幅度、钙瞬变峰值到达时间以及衰减时间(达峰至衰减50%所经历的时间),以观察药物对衰竭心肌细胞钙瞬变的影响。3.原代培养乳鼠心肌细胞,利用激光共聚焦显微技术观察心肌细胞钙离子浓度变化,以钙瞬变峰值、钙瞬变达峰时间、达峰速度、钙瞬变衰减时间和衰减速度为检测指标来反应心肌细胞钙释放和钙摄取能力。细胞分4组,每组在观察心肌细胞自发活动钙瞬变后分别加入地尔硫卓(10umol/L)、钌红(10umol/L),氯化镍(5mol/L)、咖啡因(10mol/L)后,观察钙瞬变情况后均再加入CVB-D (10-5mol/L)后,再次观察心肌细胞的钙瞬变各指标的改变,以此评价药物对钙循环相关蛋白功能的影响。4.采用冠脉结扎法复制缺血性心衰大鼠模型,将造模大鼠分为模型组、卡托普利组、CVB1.0mg/kg组和CVB2.0mg/kg组,每组8只。另加假手术组大鼠8只,共计5组。给药30天后取心脏,通过免疫荧光组织化学法、western blot和RT-PCR法观察LTCC、RYR2、 SERCA2a、NCX四种钙循环通道蛋白功能和相关mRNA转录水平,拟从钙循环相关蛋白表达的变化上进一步阐明药物对缺血性心衰的保护作用机制。结果：1.与假手术组比较,模型组存活率、LVPWd、 IVS、 EF, LVFS、CO、 SV、 CI、 A峰、LVSP,±dp/dtmax、左室微循环、心肌组织Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均可见显著减少(P<0.05,0.01),而LVIDs、LVESV.HR.E峰、E/A、 HR、 LVEDP、 t-dp/dtmax、射血时间、血浆ANP, AngII和ET含量、LVM, HM、 LVMI HMI的显著增加(P<0.05,0.01)。心肌HE染色结果表明模型组心肌细胞肥大,肌纤维排列紊乱,粗细不等,局部断裂。间质小血管增生,血管壁增厚,周围纤维组织增生,组织损伤程度评分显著增加(P<0.05,0.01)。Masson三色法染色中,假手术组左心室基本无纤维化组织,而模型组大鼠左心室中大量心肌细胞坏死、消失形成大量胶原纤维,ICVF显著增加(P<0.05,0.01)。模型组心肌细胞超微结构有严重损伤,心肌细胞核固缩,核膜边界发生断裂,轮廓不清。肌原纤维排列紊乱、断裂及缺失,相邻肌纤维间闰盘间隙明显增宽。线粒体可见散布于细胞外,嵴紊乱、部分断裂,可见空泡化。以上结果提示缺血性心衰模型已形成。CVB-D三个剂量组(0.5、1.0和2.0mg/kg)可见LVIDs、 LVESV. HR、 E/A、 LVM、 HM、 LVMIIHMI、血浆ANP水平的显著降低,CO、 CI、 SV、 EF、 LVFS、心肌组织Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的显著增加(与模型组比较P<0.05,0.01)。而中、高剂量组还可降低E峰,减少血浆Ang Ⅱ和ET含量,升高Na+-K+-ATP酶活性(与模型组比较P<0.05,0.01)。而高剂量组还可见A峰、SAP、 LVSP.±dp/dtmax、左室微循环的增加,同时减少HR、 LVEDP、 t-dp/dtmax,缩短射血时间(与模型组比较P<0.05,0.01)。HE检查表明CVB-D低、中、高剂量组可见肌纤维排列较有序、整齐,心肌细胞轻度肥大,间质少量炎细胞浸润,间质纤维组织轻度增生,染色相对均匀,显著降低病理评分(与模型组比较P<0.05,0.01)。Masson染色中CVB-D低、中、高剂量组可见心肌细胞数目明显增多,排列规则有序,胶原纤维明显减少,ICVF也见显著降低(与模型组比较P<0.05,0.01)。电镜检查发现CVB-D低、中、高剂量组,可见心肌细胞肌原纤维接近正常,排列较紧密,细胞核接近正常,核膜边界有明显改善,线粒体体积变小,空泡状态明显减少,无纤维紊乱、断裂及缺失,较接近正常组。2.利用激光共聚焦观察急性分离心肌细胞[Ca2+]i实验中发现CVB(0.5,1.0,2.0mg/kg)可显著增加钙瞬变幅度,缩短钙瞬变达峰时间和衰减时间(与模型组比较P<0.05,0.01)。3.在乳鼠心肌细胞[Ca2+]i检测中,钌红阻断乳鼠心肌细胞RYR2通道后,可见钙瞬变幅度和达峰速度显著降低,衰减时间的显著缩短(与自发状态比,P<0.05,0.01)。给予CVB-D后,并未见钙瞬变各指标的显著改变(与钉红处理相比,P>0.05)。地尔硫卓注射液阻断乳鼠心肌细胞LTCC后,可见钙瞬变幅度显著降低,同时衰减时间显著缩短(与自发状态比,P<0.01)。给予CVB-D后,可见钙瞬变幅度和达峰速度的显著增加(与钌红处理相比,P<0.01)。NiCl2阻断乳鼠心肌细胞NCX后,可见钙瞬变衰减时间显著延长和衰减速度的减慢(与自发状态比,P<0.05,0.01)。给予CVB-D后,可见钙瞬变幅度、达峰速度和衰减速度的显著增加(与钌红处理相比,P<0.01),衰减时间有进一步延长的趋势。咖啡因促使乳鼠心肌细胞SERCA2a失活后,可见钙瞬变幅度,钙瞬变速度、衰减速度的显著增加,达峰时间和衰减时间的显著延长(与自发状态比,P<0.05,0.01)。给予CVB-D后,衰减时间可见进一步延长(与钌红处理相比,P<0.05)。4.心衰模型组大鼠RYR2, SERCA2a蛋白表达和mRNA转录水平均显著低于假手术组大鼠,而NCX的表达和转录水平却显著高于假手术组大鼠(P<0.05,0.01)。CVB-D1.0,2.0mg/kg显著抑制了心衰所致的RYR2、SERCA2a蛋白表达和mRNA转录水平的减少,同时也抑制了NCX蛋白表达和mRNA转录水平的增加(P<0.05,0.01)。而各组大鼠LTCC表达未见显著改变。结论：对于缺血性心衰,CVB-D通过调节心肌细胞内LTCC、RYR2、SERCA2a、NCX四种钙循环通路蛋白中后三种蛋白的功能,保证心肌细胞收缩时有足够数量的钙离子释放,舒张时又能通过促进钙回摄迅速降低胞内钙离子浓度,从而促进胞内钙离子的有效循环利用,减少钙流失,从而改善衰竭心脏的舒缩功能。CVB-D的这种改善钙循环的作用不管是对心脏泵血功能的增强,还是对于心肌细胞的保护均具有一定积极意义。