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目的
在多种累及视网膜的疾病中，虽然病因不一样，但光感受器细胞损伤或丢失是普遍存在的现象，为导致不可逆盲的最主要原因。视网膜内可能具有分裂能力的细胞无法直接向光感受器细胞分化，缺乏有效的自我修复机能。目前临床上多数该类疾病暂无有效治疗方法。有研究表明光感受器前体细胞移植后可在眼内存活，并发育为有功能的光感受器细胞，或可获得部分视网膜感光功能，目前被认为是最具潜力治愈或缓解眼盲的方式。大量健康可用于移植的细胞获取是亟待解决的问题。尽管很多实验室致力于分化人类多能干细胞，从而获取光感受器细胞，但其效率有一定限制。本实验构建了可示踪光感受器细胞的细胞系，可直观观察视网膜类器官的发育，并通过改变调控信号通路的方式，在视网膜类器官分化早期获得更多的光感受器前体细胞，晚期可能获得更多的视锥细胞，为以后进行细胞移植奠定基础。
方法
本研究首先通过CRISPR/Cas9技术，在hESH9细胞系的CRX启动子后添加tdTomato荧光蛋白的cDNA片断，构建一株能示踪CRX表达的人胚胎干细胞系（命名为CRXp-tdTomato)，并利用体外三维视网膜诱导分化的方式，在Wnt通路抑制剂IWR1e调控下，于96孔V形低黏附板中形成拟胚体，并逐渐向外胚层和视网膜感光细胞方向分化，形成具有分层结构的视网膜类器官。利用qPCR、流式细胞分析及免疫荧光染色的方法探究tdTomato的表达特点及视网膜类器官的基因表达情况，并与同期的hESH9来源的视网膜类器官比较。最后将BMP、Nodal/TGF-β及Wnt通路的拮抗剂—COCO蛋白加入三维分化系统，探索COCO适宜的添加时间，再利用细胞流式分析、qPCR及免疫染色，检测多个阶段视网膜相关基因的表达情况。
结果
1.我们构建了可示踪CRX表达的细胞系CRXp-tdTomato，该细胞系表达SOX2、OCT4、SSEA4等多能性标记蛋白及碱性磷酸酶，并具有向多胚层分化的干细胞特性，核型正常。
2.该细胞系在IWR1e、SAG、RA等调控下可向具有多层结构的视网膜类器官分化。类器官在分化第90天内可检测到多种视网膜细胞或神经细胞特异性标记物PAX6、光感受器前体细胞CRX、Recoverin、NRL等表达；至分化185天时可检测到S-opsin及Rhodopsion（RHO）的表达；M-opsin出现时间更晚，其中tdTomato表达与CRX表达呈正相关。
3.在视网膜类器官的分化早期，CRXp-tdTomato与hESH9细胞系来源的视网膜类器官相关基因表达差异不大。
4.长时间COCO的添加不能更有效使多能干细胞分化为视网膜类器官，并且CRX表达量未见提升。
5.COCO蛋白在前12天添加至培养基后，OTX2及CRX的表达量分别在分化35天和45天时增加明显；在分化90天时与S-cone相关的S-opsin表达上调，但增加倍数无统计学差异，M-opsin、RHO及NRL表达下降。
结论
本课题成功获得一株示踪CRX表达的hES细胞系，该细胞系仍具有多能性，能稳定传代、冻存和复苏。在体外该细胞系可被诱导形成含多种视网膜细胞的且具有多层结构的视网膜类器官，其中可观察到荧光蛋白tdTomato的表达，该蛋白可真实示踪CRX表达。荧光蛋白的敲入对分化早期的视网膜类器官影响较小，因此该示踪细胞系可用于探究物质对视网膜发育早期的影响。COCO蛋白加入三维分化系统可使CRX早期表达量增加，同时S-opsin表达可能增加，M-opsin、RHO及NRL表达下降，与小鼠体内及2D分化中结果相符。该研究验证了该细胞系在研究小分子对视网膜早期发育影响实验中的可用性，提高了早期视网膜感光细胞分化效率，短期可获得更多光感受器前体细胞。
在多种累及视网膜的疾病中，虽然病因不一样，但光感受器细胞损伤或丢失是普遍存在的现象，为导致不可逆盲的最主要原因。视网膜内可能具有分裂能力的细胞无法直接向光感受器细胞分化，缺乏有效的自我修复机能。目前临床上多数该类疾病暂无有效治疗方法。有研究表明光感受器前体细胞移植后可在眼内存活，并发育为有功能的光感受器细胞，或可获得部分视网膜感光功能，目前被认为是最具潜力治愈或缓解眼盲的方式。大量健康可用于移植的细胞获取是亟待解决的问题。尽管很多实验室致力于分化人类多能干细胞，从而获取光感受器细胞，但其效率有一定限制。本实验构建了可示踪光感受器细胞的细胞系，可直观观察视网膜类器官的发育，并通过改变调控信号通路的方式，在视网膜类器官分化早期获得更多的光感受器前体细胞，晚期可能获得更多的视锥细胞，为以后进行细胞移植奠定基础。
方法
本研究首先通过CRISPR/Cas9技术，在hESH9细胞系的CRX启动子后添加tdTomato荧光蛋白的cDNA片断，构建一株能示踪CRX表达的人胚胎干细胞系（命名为CRXp-tdTomato)，并利用体外三维视网膜诱导分化的方式，在Wnt通路抑制剂IWR1e调控下，于96孔V形低黏附板中形成拟胚体，并逐渐向外胚层和视网膜感光细胞方向分化，形成具有分层结构的视网膜类器官。利用qPCR、流式细胞分析及免疫荧光染色的方法探究tdTomato的表达特点及视网膜类器官的基因表达情况，并与同期的hESH9来源的视网膜类器官比较。最后将BMP、Nodal/TGF-β及Wnt通路的拮抗剂—COCO蛋白加入三维分化系统，探索COCO适宜的添加时间，再利用细胞流式分析、qPCR及免疫染色，检测多个阶段视网膜相关基因的表达情况。
结果
1.我们构建了可示踪CRX表达的细胞系CRXp-tdTomato，该细胞系表达SOX2、OCT4、SSEA4等多能性标记蛋白及碱性磷酸酶，并具有向多胚层分化的干细胞特性，核型正常。
2.该细胞系在IWR1e、SAG、RA等调控下可向具有多层结构的视网膜类器官分化。类器官在分化第90天内可检测到多种视网膜细胞或神经细胞特异性标记物PAX6、光感受器前体细胞CRX、Recoverin、NRL等表达；至分化185天时可检测到S-opsin及Rhodopsion（RHO）的表达；M-opsin出现时间更晚，其中tdTomato表达与CRX表达呈正相关。
3.在视网膜类器官的分化早期，CRXp-tdTomato与hESH9细胞系来源的视网膜类器官相关基因表达差异不大。
4.长时间COCO的添加不能更有效使多能干细胞分化为视网膜类器官，并且CRX表达量未见提升。
5.COCO蛋白在前12天添加至培养基后，OTX2及CRX的表达量分别在分化35天和45天时增加明显；在分化90天时与S-cone相关的S-opsin表达上调，但增加倍数无统计学差异，M-opsin、RHO及NRL表达下降。
结论
本课题成功获得一株示踪CRX表达的hES细胞系，该细胞系仍具有多能性，能稳定传代、冻存和复苏。在体外该细胞系可被诱导形成含多种视网膜细胞的且具有多层结构的视网膜类器官，其中可观察到荧光蛋白tdTomato的表达，该蛋白可真实示踪CRX表达。荧光蛋白的敲入对分化早期的视网膜类器官影响较小，因此该示踪细胞系可用于探究物质对视网膜发育早期的影响。COCO蛋白加入三维分化系统可使CRX早期表达量增加，同时S-opsin表达可能增加，M-opsin、RHO及NRL表达下降，与小鼠体内及2D分化中结果相符。该研究验证了该细胞系在研究小分子对视网膜早期发育影响实验中的可用性，提高了早期视网膜感光细胞分化效率，短期可获得更多光感受器前体细胞。