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遗传性凝血因子Ⅺ(congulationfactorⅪ,FⅪ)缺陷症为常染色体隐性遗传性疾病，首先由Rosenthal等在1953年报道，既往被称为血友病C，是FⅪ缺陷引起的出血性疾病。该病在人群中的发生率约为1/10万～1/100万，犹太人和法国巴斯克地区发生率较高，但在中国人群中较为罕见。遗传性纤溶酶原缺陷症是一种罕见的常染色体遗传疾病，是纤溶酶原（Plasminogen，PLG）含量或质量异常引起的疾病，分为Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型患病率理论上为1.6/100万，而Ⅱ型主要集中在亚洲国家。本文通过对一例遗传性FⅪ缺陷症患者和一例遗传性PLG缺陷症患者及家系进行表型与基因突变检测，初步探讨其发病的分子遗传学基础。
方法
1、实验室表型检查
采集先证者与其家系成员的外周血标本，用0.109mol/L枸橼酸钠1:9抗凝，离心分离出乏血小板血浆用于凝血功能检测，血细胞用于制备基因组DNA。凝血指标检测如下：活化部分凝血活酶时间(ActivatedPartialThromboplastinTime,APTT)、凝血酶原时间(ProthrombinTime,PT)、凝血酶时间（ThrombinTime,TT）、纤维蛋白原(Fibrinogen,FIB)、凝血因子Ⅷ活性(CongulationfactorⅧactivity,FⅧ:C)、凝血因子Ⅸ活性(CongulationfactorⅨactivity,FⅨ:C)、凝血因子Ⅺ活性(CongulationfactorⅪactivity,FⅪ:C)、凝血因子Ⅻ活性(CongulationfactorⅫactivity,FⅫ:C)、蛋白S活性（ProteinSactivity,PS:A）等均采用凝固法测定；D-二聚体（D-dimer,D-D）和纤维蛋白(原)降解产物(Fibrinogendegradationproduct,FDP)采用免疫比浊法测定；抗凝血酶活性(Antithrombinactivity,AT:A)、蛋白C活性（ProteinCactivity,PC:A）、纤溶酶原活性（Plasminogenactivity,PLG:A）等采用发色底物法测定；凝血因子Ⅺ抗原（CongulationfactorⅪantigen,FⅪ:Ag）和纤溶酶原抗原（Plasminogenantigen,PLG:Ag）采用酶联免疫吸附法测定。
2、基因提取检测
应用非离心柱型基因组DNA提取系统抽提先证者及其家系成员外周血基因组DNA，并用核酸蛋白分析仪DU800检测基因组DNA的浓度和纯度。PCR扩增F11及PLG基因所有外显子区域及其侧翼序列和启动子序列。PCR扩增产物采用Goldview标记，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，割胶回收送上海桑尼生物工程有限公司测序。测序结果用Chromas软件与美国NCBI基因库所公布的F11基因序列(GenbankAY191837)和PLG基因序列(GenbankAY192161.1)分别进行比对，寻找基因突变位点，反向测序予以确认。其他家系成员在先证者明确基因突变位点后，再进行相应区域的PCR扩增及测序。
3、生物信息学技术分析
应用ClustalX-2.1-win软件将突变氨基酸进行同源物种序列保守性分析；利用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和MutationTaster四个在线生物信息学软件分析突变氨基酸对蛋白质功能的影响；运用Swiss-PdbViewer4.1.0软件，基于已知的FⅪ和PLG蛋白结构模型，对突变的蛋白建模进行比对分析。
结果
一、在遗传性凝血因子XI缺陷症家系中
1、先证者及其姐姐APTT明显延长，FⅪ:C和FⅪ:Ag明显降低，分别为73.0s、10.0%、15.0%和87.1s、2.0%、11.5%；其父亲、母亲、妹妹、外甥及女儿的APTT均稍有延长，且FⅪ:C和FⅪ:Ag也均有不同程度降低；上述人员FⅧ:C、FⅨ:C和FⅫ:C均正常，先证者及家系成员其他相关的凝血指标检测结果也基本正常。
2、基因测序发现先证者第7号外显子编码第228位氨基酸的碱基发生c.738G＞A杂合无义突变，导致色氨酸转为终止密码(p.Trp228stop)；第9号外显子编码第295位氨基酸的碱基发生c.938G＞T杂合错义突变，使丝氨酸转为异亮氨酸(p.Ser295Ile)。先证者姐姐和其具有同样的基因突变，即皆为p.Trp228stop与p.Ser295Ile的复合杂合子；其父亲、妹妹及女儿仅有7号外显子的突变，为p.Trp228stop杂合子；母亲和外甥（姐姐的儿子）仅有9号外显子的突变，为p.Ser295Ile杂合子。
3、对FⅪ错义突变p.Ser295Ile进行分析，PolyPhen-2评分结果为0.840分，预示此突变很可能是有害突变；SIFT评分结果为0.00分，预示此突变可影响蛋白质的功能；突变蛋白模型分析显示，Ser295可与相邻的His296及空间折叠的Tyr314各形成一个氢键，当Ser295突变为Ile295时，其主干虽依然与His296共价键相连，但其与之没有形成氢键，分子间作用力减弱。
二、在遗传性纤溶酶原缺陷症家系中
1、先证者和其祖父、父亲PLG:A均降低为正常值的50%左右，PLG:Ag含量正常，结果分别为45%、95%，64%、94%和64%、104%，初步认为三人均属于纤溶酶原抗原水平正常但活性水平低的Ⅱ型缺陷症患者。
2、基因测序发现先证者第15号外显子编码第601位氨基酸的碱基发生c.1858G＞A杂合错义突变，导致丙氨酸转为苏氨酸(p.Ala601Thr)。其祖父和父亲具有同样的基因突变，即皆为p.Ala601Thr的杂合子。
3、对PLG错义突变p.Ala601Thr进行分析，Ala601在其11个同源物种间高度保守；PolyPhen-2，PROVEAN，SIFT和MutationTaster四个在线生物信息学软件分析突变对蛋白的影响程度，预测结果一致；突变蛋白模型分析显示，Ala601可与相邻的Thr600形成两个氢键，与Cys604形成一个氢键，当Ala601突变为Thr601时，Thr601分子侧链变长，其侧链与Asp646形成两个氢键，与His603形成一个氢键。
结论
1、遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系先证者FⅪ:C与FⅪ:Ag下降程度一致，表现为交叉反应物质（CRM）阴性的特点。
2、复合杂合F11基因突变p.Trp228stop杂合子和p.Ser295Ile杂合子与该先证者FⅪ水平降低有关，其中p.Ser295Ile突变为世界上首次报道。
3、遗传性纤溶酶原缺陷症家系先证者PLG:Ag含量正常但PLG:A水平降低，表现为纤溶酶原Ⅱ型缺陷症的特点。
4、PLG基因p.Ala601Thr杂合错义突变与该家系PLG:A水平降低有关，p.Ala601Thr突变导致的遗传性纤溶酶原缺陷症在我国较罕见。
方法
1、实验室表型检查
采集先证者与其家系成员的外周血标本，用0.109mol/L枸橼酸钠1:9抗凝，离心分离出乏血小板血浆用于凝血功能检测，血细胞用于制备基因组DNA。凝血指标检测如下：活化部分凝血活酶时间(ActivatedPartialThromboplastinTime,APTT)、凝血酶原时间(ProthrombinTime,PT)、凝血酶时间（ThrombinTime,TT）、纤维蛋白原(Fibrinogen,FIB)、凝血因子Ⅷ活性(CongulationfactorⅧactivity,FⅧ:C)、凝血因子Ⅸ活性(CongulationfactorⅨactivity,FⅨ:C)、凝血因子Ⅺ活性(CongulationfactorⅪactivity,FⅪ:C)、凝血因子Ⅻ活性(CongulationfactorⅫactivity,FⅫ:C)、蛋白S活性（ProteinSactivity,PS:A）等均采用凝固法测定；D-二聚体（D-dimer,D-D）和纤维蛋白(原)降解产物(Fibrinogendegradationproduct,FDP)采用免疫比浊法测定；抗凝血酶活性(Antithrombinactivity,AT:A)、蛋白C活性（ProteinCactivity,PC:A）、纤溶酶原活性（Plasminogenactivity,PLG:A）等采用发色底物法测定；凝血因子Ⅺ抗原（CongulationfactorⅪantigen,FⅪ:Ag）和纤溶酶原抗原（Plasminogenantigen,PLG:Ag）采用酶联免疫吸附法测定。
2、基因提取检测
应用非离心柱型基因组DNA提取系统抽提先证者及其家系成员外周血基因组DNA，并用核酸蛋白分析仪DU800检测基因组DNA的浓度和纯度。PCR扩增F11及PLG基因所有外显子区域及其侧翼序列和启动子序列。PCR扩增产物采用Goldview标记，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，割胶回收送上海桑尼生物工程有限公司测序。测序结果用Chromas软件与美国NCBI基因库所公布的F11基因序列(GenbankAY191837)和PLG基因序列(GenbankAY192161.1)分别进行比对，寻找基因突变位点，反向测序予以确认。其他家系成员在先证者明确基因突变位点后，再进行相应区域的PCR扩增及测序。
3、生物信息学技术分析
应用ClustalX-2.1-win软件将突变氨基酸进行同源物种序列保守性分析；利用PolyPhen-2、PROVEAN、SIFT和MutationTaster四个在线生物信息学软件分析突变氨基酸对蛋白质功能的影响；运用Swiss-PdbViewer4.1.0软件，基于已知的FⅪ和PLG蛋白结构模型，对突变的蛋白建模进行比对分析。
结果
一、在遗传性凝血因子XI缺陷症家系中
1、先证者及其姐姐APTT明显延长，FⅪ:C和FⅪ:Ag明显降低，分别为73.0s、10.0%、15.0%和87.1s、2.0%、11.5%；其父亲、母亲、妹妹、外甥及女儿的APTT均稍有延长，且FⅪ:C和FⅪ:Ag也均有不同程度降低；上述人员FⅧ:C、FⅨ:C和FⅫ:C均正常，先证者及家系成员其他相关的凝血指标检测结果也基本正常。
2、基因测序发现先证者第7号外显子编码第228位氨基酸的碱基发生c.738G＞A杂合无义突变，导致色氨酸转为终止密码(p.Trp228stop)；第9号外显子编码第295位氨基酸的碱基发生c.938G＞T杂合错义突变，使丝氨酸转为异亮氨酸(p.Ser295Ile)。先证者姐姐和其具有同样的基因突变，即皆为p.Trp228stop与p.Ser295Ile的复合杂合子；其父亲、妹妹及女儿仅有7号外显子的突变，为p.Trp228stop杂合子；母亲和外甥（姐姐的儿子）仅有9号外显子的突变，为p.Ser295Ile杂合子。
3、对FⅪ错义突变p.Ser295Ile进行分析，PolyPhen-2评分结果为0.840分，预示此突变很可能是有害突变；SIFT评分结果为0.00分，预示此突变可影响蛋白质的功能；突变蛋白模型分析显示，Ser295可与相邻的His296及空间折叠的Tyr314各形成一个氢键，当Ser295突变为Ile295时，其主干虽依然与His296共价键相连，但其与之没有形成氢键，分子间作用力减弱。
二、在遗传性纤溶酶原缺陷症家系中
1、先证者和其祖父、父亲PLG:A均降低为正常值的50%左右，PLG:Ag含量正常，结果分别为45%、95%，64%、94%和64%、104%，初步认为三人均属于纤溶酶原抗原水平正常但活性水平低的Ⅱ型缺陷症患者。
2、基因测序发现先证者第15号外显子编码第601位氨基酸的碱基发生c.1858G＞A杂合错义突变，导致丙氨酸转为苏氨酸(p.Ala601Thr)。其祖父和父亲具有同样的基因突变，即皆为p.Ala601Thr的杂合子。
3、对PLG错义突变p.Ala601Thr进行分析，Ala601在其11个同源物种间高度保守；PolyPhen-2，PROVEAN，SIFT和MutationTaster四个在线生物信息学软件分析突变对蛋白的影响程度，预测结果一致；突变蛋白模型分析显示，Ala601可与相邻的Thr600形成两个氢键，与Cys604形成一个氢键，当Ala601突变为Thr601时，Thr601分子侧链变长，其侧链与Asp646形成两个氢键，与His603形成一个氢键。
结论
1、遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系先证者FⅪ:C与FⅪ:Ag下降程度一致，表现为交叉反应物质（CRM）阴性的特点。
2、复合杂合F11基因突变p.Trp228stop杂合子和p.Ser295Ile杂合子与该先证者FⅪ水平降低有关，其中p.Ser295Ile突变为世界上首次报道。
3、遗传性纤溶酶原缺陷症家系先证者PLG:Ag含量正常但PLG:A水平降低，表现为纤溶酶原Ⅱ型缺陷症的特点。
4、PLG基因p.Ala601Thr杂合错义突变与该家系PLG:A水平降低有关，p.Ala601Thr突变导致的遗传性纤溶酶原缺陷症在我国较罕见。