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目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因RNA干扰表达载体,同时构建p53上调凋亡调控因子(PUMA)的促表达载体,探讨hTERT基因及PUMA基因单独和联合作用对MCF-7细胞增殖抑制和凋亡效应,为肿瘤联合基因治疗提供实验依据。
方法:设计针对hTERT基因的RNA干扰序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT(1524-1544),合成具有该靶序列短发夹结构的寡核苷酸,经退火形成双链DNA,用T4 DNA连接酶连接到线性化pYr-2.1质粒U6启动子下游,构建成重组质粒pYr-2.1-hTERT-shRNA。将重组质粒转化感受态细胞DH5α,经摇菌扩增,抽提纯化质粒,通过酶切及测序鉴定确定重组质粒构建成功。同法构建不针对任何基因的阴性对照质粒。另合成PUMA基因的表达序列克隆至pUC57载体上,构建表达载体pUC57-PUMA并鉴定。把pUC57-PUMA和pYr-adshuttle-1分别用BamH I和EcoR I酶切,T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pYr-adshuttle-1-PUMA,经酶切鉴定确认重组质粒pYr-adshuttle-1-PUMA构建成功。乳腺癌MCF-7细胞常规培养,于转染前一日接种于6孔板,将以上两种载体的荧光对照质粒pYr-2.1-EGFP和pYr-adshuttle-1-RFP分别单独、联合转染入细胞,转染后48h,荧光显微镜下观察绿色及红色荧光细胞所占的比例,以此判断转染效率。实验设置hTERT干扰组、PUMA表达组、hTERT／PUMA联合组、干扰阴性对照组(HK group)、表达阴性对照组(adshuttle-1 group)和空白组(blank group),将以上构建的质粒分别转染各组细胞(空白组加等量PBS)。转染后48h通过western blot检测各组细胞中hTERT和PUMA蛋白的相对表达量；流式细胞仪检测细胞的凋亡率和周期分布；CCK-8法于转染后1～4d天检测细胞的生长抑制情况。
结果:1.重组质粒pYr-2.1-hTERT-shRNA和pYr-adshuttle-1-PUMA经酶切及测序鉴定证实目的序列插入正确,重组质粒构建成功。2.转染后48h在荧光显微镜下观察,根据荧光细胞所占比例判断转染效率均达60％左右。3.免疫印迹结果分析显示:hTERT干扰组与空白组相比hTERT蛋白的相对表达量下降了54.4％；hTERT／PUMA联合组与空白组相比hTERT蛋白的相对表达量下降了52.3％；PUMA表达组与空白组相比PUMA蛋白的相对表达量增加了168.4％；hTERT／PUMA联合组与空白组相比PUMA蛋白的相对表达量增加了158.6％。4.CCK-8实验结果显示:hTERT组、PUMA组和hTERT／PUMA联合组在1～4d内细胞生长缓慢、增殖显著抑制；hTERT／PUMA联合组对MCF-7细胞的增殖抑制作用明显强于hTERT组和PUMA组。5.流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布显示:转染后48h,hTERT组、PUMA组和hTERT／PUMA联合组细胞凋亡率分别为9.87％、19.02％、31.46％,hTERT组和hTERT／PUMA联合组的细胞周期阻滞于G0／G1期,PUMA组的细胞周期基本无变化,hTERT／PUMA联合组比hTERT组和PUMA组细胞周期阻滞更明显。
结论:1.成功构建针对hTERT基因的shRNA表达载体pYr-2.1-hTERT-shRNA,该载体可以特异性地抑制乳腺癌MCF-7细胞中hTERT基因的表达。2.成功构建了针对PUMA基因的促表达载体pYr-adshuttle-1-PUMA,该载体可以在乳腺癌组织中增加PUMA蛋白量的表达量。3.pYr-2.1-hTERT-shRNA和pYr-adshuttle-1-PUMA单独转染人乳腺癌MCF-7细胞后均能促进细胞凋亡、抑制细胞增殖,联合转染后细胞凋亡增加,细胞增殖抑制更明显,二者具有协同效应,hTERT和PUMA联合是肿瘤基因治疗作用靶点的有益选择。