中性粒细胞是机体防御体外微生物入侵的主要参与者之一,在先天免疫反应中起着重要作用。研究发现中性粒细胞可通过释放中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps,NETs）参与清除入侵的病原体及外来微生物。关于NETs形成的具体机制目前仍存在争议,近年的研究认为PAD4催化的组蛋白瓜氨酸化对NETs的形成是至关重要的。大量研究指出NETs在炎症损伤、血栓形成甚至肿瘤转移中发挥着“双刃剑”的作用,越来越多的研究致力于消除NETs在疾病进程中的负面影响。染色质结构的解析是阐明染色质动力学在基因表达的表观遗传调控中的作用的关键。天然的染色质纤维在核内或从核中分离出来的结构是一个规则的螺旋状核小体多聚体,直径约30 nm,每11 nm约堆积6-7个核小体。核小体可以线性地排列在带有弯曲连接物DNA的螺线管型螺旋中,或者以来回之字形排列在由相对直的DNA连接物连接的两个起始堆叠的核小体中。然而,核小体核心颗粒（NCP）在串珠式核小体阵列中如何相互作用形成紧缩型30 nm染色质纤维的具体调节机制仍未研究清楚。PAD4（肽酰基精氨酸脱亚胺酶4）,最先发现于HL-60细胞中,是一种Ca2+依赖的蛋白修饰酶,在2004年Wang等人详细阐明了PAD4的催化机理,可将肽酰精氨酸残基转变为肽酰瓜氨酸残基。组蛋白H3的N端非DNA结合区具有多个精氨酸残基暴露,PAD4可通过催化组蛋白H3的精氨酸瓜氨酸化修饰使得染色质解聚促进NETs产生。通过PAD4介导中性粒细胞组蛋白瓜氨酸化,使染色质解聚,从而促进NETs的形成。本研究在原核表达系统中表达组蛋白,仅使用一个原核表达载体同时表达组蛋白H2A、H2B、H3和H4。在组蛋白H2A和H4的N端依次加入His6-Tag和Thrombin蛋白酶切位点。鉴于组蛋白H2A-H2B和H3-H4之间的相互作用特性,使用镍柱亲和纯化一次便可得到四种组蛋白,在组蛋白纯化后使用Thrombin蛋白酶切除His-Tag。将Widom601序列合成于p UC57载体,通过PCR扩增获得197 bp的组装DNA序列。将纯化后His-Tag切除的四种组蛋白与组装DNA混合于2 M的Na Cl溶液中,4℃低温环境下,通过盐密度梯度透析方法,逐级将Na Cl溶液的浓度降低至0.2 M,在体外组装核小体。使用native-PAGE电泳和EMSA检测组装核小体,核小体DNA较游离的DNA具有明显的迁移滞后性,显示在体外成功组装核小体。使用原核表达载体p Cold I表达PAD4蛋白,并检测酶活性,在体外将PAD4与组蛋白共孵育使组蛋白瓜氨酸化。通过盐密度梯度透析方法体外组装瓜氨酸化核小体,使用原子力显微镜（AFM）对瓜氨酸化核小体和非瓜氨酸化核小体形态结构进行表征,瓜氨酸化核小体结构松散,致密性降低。荧光共振能量转移（FRET）和荧光热漂移（FTS）分别检测不同盐离子浓度和不同温度条件下两种核小体的稳定性,荧光共振能量转移结果表明瓜氨酸化核小体较非瓜氨酸化核小体特定位点DNA的线性距离上更长,可影响染色质丝致密度降低;荧光热漂移实验结果表明瓜氨酸化组蛋白八聚体稳定性更低;以上实验表明瓜氨酸化核小体致密性降低,更容易解聚。提取PAD4-/-的4T1细胞系中染色质,并在体外与PAD4共孵育制备瓜氨酸化染色质,使用透射电镜检测瓜氨酸化染色质和非瓜氨酸化染色质的形态结构,结果表明瓜氨酸化后核小体堆积程度低,染色质结构更加松散。综上所述,PAD4将核小体中组蛋白瓜氨酸化导致组蛋白八聚体稳定性降低,核小体堆积程度降低,从而使染色质结构松散导致染色质解聚,使中性粒细胞释放解聚的染色质形成网状染色质丝,即形成NETs。因此,PAD4催化的组蛋白瓜氨酸化对NETs形成至关重要。