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nsdA是本实验室首次发现的一个全局性负调控基因,对天蓝色链霉菌抗生素的合成和产孢形态分化具有负调节作用。nsdA的中断菌株能够提前且超量产生放线紫红素、钙依赖抗生素、次甲基霉素,同时产孢量也增多。本研究的目的是研究nsdA基因在其它链霉菌特别是重要抗生素产生菌中是否广泛存在,并用于构建抗生素高产菌株。 在本论文中,用天蓝色链霉菌nsdA片断为探针进行Southern杂交,在阿维链霉菌NRRL8165、吸水链霉菌5008、白色链霉菌JA3453、金色链霉菌211、变铅青链霉菌ZX64、链霉菌FR-008 DX600、吸水链霉菌10-22等7种链霉菌中都有杂交信号;并且PCR扩增都有明显的特征带。表明这些菌株中都含有nsdA的同源基因。 变铅青链霉菌含有沉默的放线紫红素生物合成基因簇。对ZX64菌株的nsdA进行PCR扩增及序列测定,结果表明该基因与天蓝色链霉菌A3(2)的nsdA有100%的核苷酸序列一致性。用基于同源重组的原理中断ZX64的nsdA,抗性筛选获得中断菌株WQ2,PCR实验从分子水平上证明WQ2染色体中的nsdA已被中断。与沉默的野生型菌株ZX64相比,WQ2能够合成放线紫红素;在WQ2中引入野生型nsdA,使互补菌株重新失去产抗生素能力。结果表明nsdA对变铅青链霉菌抗生素合成具有负调节作用,中断nsdA能激活沉默的抗生素生物合成基因。 根据已测序的阿维链霉菌MA-4680菌株的序列设计引物,从阿维链霉菌NRRL8165中PCR扩增出包括nsdA同源基因nsdAav及其两侧序列的5.7kb的片段并测序验证。接着构建了nsdAav的中断质粒pHL214,把该质粒接合转移到阿维链霉菌NRRL8165中,筛选得到中断菌株WQ5-1和WQ5-2,PCR验证中断菌株中nsdAav基因已被正确中断。对中断菌株的发酵产物HPLC的分析表明中断菌株阿维菌素的效价提高了大约3~5倍。 根据天蓝色链霉菌的序列设计引物,从吸水链霉菌5008中PCR扩增出包括nsdA同源基因nsdAjg及其两侧序列的4.7kb的片段并测序。测序结果表明nsdAjg与天蓝色链霉菌基因组序列具有86%核苷酸序列相似性。另外构建了中断质粒pHL202和pHL213。但是不能成功的把中断质粒接合转移导入到吸水链霉菌5008菌株中,有关接合转移系统有待进一步研究。