【摘 要】
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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)诱发的乳腺炎一直是抗乳腺炎机理研究中较为复杂且重要的部分。其在临床上多呈慢性、亚临床性、反复性发病,给奶山羊养殖业
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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)诱发的乳腺炎一直是抗乳腺炎机理研究中较为复杂且重要的部分。其在临床上多呈慢性、亚临床性、反复性发病,给奶山羊养殖业造成巨大的经济损失。在抗乳腺炎的研究中,乳腺特异性细菌诱导系统致力于抗菌蛋白在乳腺中的病理可调控性,能够兼顾动物乳腺不同生理时期的对病原抵抗力特征状态。白介素-1β(Interlukin-1,IL-1β)作为乳腺炎早期大量表达的细胞因子之一,在S.aureus诱发乳腺炎中扮演重要角色,其启动子可作为细菌诱导表达系统构建的重要候选。160 bp的牛β酪蛋白增强子(bovineβ-casin enhancer,BCE)含有响应催乳素和乳腺细胞外基质的应答元件,能够特异性增加外源基因在乳腺中的表达。因此,二者结构的有效组合和功能互补对构建细菌诱导乳腺特异性表达系统具有重大意义。本实验通过对山羊IL-1β启动子区域的多物种比对并结合相关文献的报道,初步预测出了两段近缘物种同源性较高的重要功能区域——远端增强区(-4161/-3653)和近端转录起始区(-651/+85)。并以高保真重叠延伸PCR的方法成功克隆出了山羊IL-1β4582bp的启动子区(包含部分CDS区)与688bp的第一内含子区。实验通过构建双荧光素酶报告载体,以5’端选择性截短的方式初步探讨了金黄色葡萄球菌诱导下山羊IL-1β启动子不同区域在293T细胞、小鼠巨噬细胞系Raw264.7和小鼠乳腺上皮细胞系HC11三种细胞中的活性以及BCE对356bp的远端增强区的增强作用的位置效应。实验结果表明包含潜在NF-κb结合位点的IL-1β远端增强区(-3911/-3555)对其他启动子片段具有非组织依赖的增强作用。实验通过将其下游依次插入近端启动子区(-560/+5)和第一内含子区(+801/+1489)能够有效响应金黄色葡萄球菌的诱导,而缺失远端增强区或第一内含子区任一部分则不能响应该诱导作用。因此山羊IL-1β启动子金黄色葡萄球菌诱导活性的实现可能是以上三者共同作用的结果。BCE能够增强不同启动子在293T细胞和HC11细胞中的本底活性,但不同程度削弱了启动子对金黄色葡萄球菌诱导的灵敏性。将牛BCE插入IL-1β远端增强区和近端启动子之间,启动子的活性下降,说明其对IL-1β远端增强区增强作用具有阻断效应,反之插入IL-1β远端增强区上游,则能够与IL-1β远端增强区共同增强近端启动子的启动活性。通过以上实验成果,探究了山羊IL-1β启动子区金黄色葡萄球菌诱导的响应模式以及BCE与对山羊IL-1β启动子诱导活性的影响,为金黄色葡萄球菌诱导IL-1β表达的机理研究奠定了基础,并为构建金黄色葡萄球菌诱导型乳腺特异性表达系统的构建提供了思路。
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