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第一部分多柔比星诱导乳鼠心肌细胞凋亡以及对蛋白硝基化的影响 目的: 体外给予多柔比星(DOX,doxorubicin)诱导乳鼠心肌细胞凋亡,检测这一过程中细胞活力、Caspase-3、PARP-1的活性等凋亡相关指标的变化和细胞内蛋白硝基化情况的变化。 方法: 体外培养的乳鼠心肌细胞,生长发育成熟后,分别给予不同浓度的多柔比星(0.1、0.3、1、3和10μmol/L)作用细胞24h,MTT法检测心肌细胞的存活率;细胞凋亡荧光试剂盒检测细胞凋亡情况,Caspase-3分光光度法检测细胞内Caspase-3的活性;western-blot法检测Cleaved PARP-1的和硝基酪氨酸(NitroTyrosine)的表达。实验分组为: 1、正常组(Control):正常培养24h; 2、0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L多柔比星组:分别给予正常培养的细胞上述终浓度多柔比星培养。 体外培养大鼠乳鼠心肌细胞,待生长发育成熟后,预孵育过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)清除剂MnTMPyP2h后,给予1μmol/L多柔比星刺激,作用24h后进行检测。MTT法检测心肌细胞的存活率;细胞凋亡荧光试剂盒进行凋亡检测;Caspase-3分光光度法检测Caspase-3的活性;western-blot法检测Cleaved PARP-1的表达和对硝基酪氨酸产生的影响。实验分组: 1、正常组(Control):正常培养24h; 2、1μmol/L多柔比星组:正常细胞给予1μmol/L多柔比星作用24h; 3、1μmol/L多柔比星+30μmol/LMnTMPyP组:预孵育30μmol/LMnTMPyP2h,给予1μmol/L多柔比星作用细胞24h; 4、给予30μmol/LMnTMPyP作用细胞24h。 结果: 1.给予乳鼠心肌细胞不同浓度的多柔比星作用24h后,MTT法检测心肌细胞的存活率。MTT值对多柔比星呈现剂量依赖性下降,1μmol/L、3μmol/L与10μmol/L多柔比星组MTT检测试剂盒检测值显著下降,与对照组MTT值比较均有显著差异(P<0.05)。 2.24h后检测胞浆Caspase-3活性,与control组相比,1、3、10μmol/L多柔比星组Caspase-3活化度分别为171.53±18.25％、176.03±10.31%、187.00±18.39%(P<0.05)。 3.多柔比星作用24h后,与control组相比,1μmol/L、3μmol/L和10μmol/L多柔比星组Cleaved PARP-1表达明显增加(P<0.05)。 4.多柔比星作用24h后检测蛋白硝基化,与control组相比,1μmol/L、3μmol/L和10μmol/L多柔比星组硝基酪氨酸(NitroTyrosine)表达明显增加(P<0.05)。 5.预孵育不同浓度(0、3、10、30、100μmol/L)的ONOO-清除剂MnTMPyP作用2h,给予1μmol/L多柔比星。24h后MTT法检测心肌细胞的存活率。与对照组比较1μmol/L多柔比星组MTT值下降(P<0.05);30μmol/L的MnTMPyP可以显著降低多柔比星对细胞的损伤,与多柔比星组比较,MTT值显著降低(P<0.05)。 6.预孵育30μmol/L MnTMPyP 2h,给予1μmol/L多柔比星。24h后,Hochest33258荧光染色。Control组细胞呈低蓝色,1μmol/L多柔比星组细胞亮度明显增高,呈亮蓝色,可观察到明显的细胞核固缩,具有凋亡的显著特征;与多柔比星组相比,MnTMPyP组凋亡情况明显减轻。 7.预孵育30μmol/L MnTMPyP 2h,给予1μmol/L多柔比星24h后,检测胞浆Caspase-3活性。与Control组相比,1μmol/L多柔比星组Caspase-3活化度为175.22±16.22%(P<0.01);与多柔比星组相比,MnTMPyP可以显著抑制Caspase-3的活化126.30±9.62%(P<0.05)。 8.预孵育30μmol/L MnTMPyP 2h,给予1μmol/L多柔比星24h后,检测Cleaved PARP-1的表达。与control组相比,1μmol/L多柔比星组Cleaved PARP-1表达明显增加(P<0.01);与多柔比星组相比,MnTMPyP组Cleaved PARP-1表达明显减少(P<0.05)。 9.预孵育30μmol/L MnTMPyP 2h,给予1μmol/L多柔比星24h后,检测细胞硝基酪氨酸的含量,多柔比星作用24h后,与Control组相比,1μmol/L多柔比星组硝基酪氨酸表达明显增加,预孵育MnTMPyP组硝基酪氨酸表达较多柔比星组明显降低(P<0.05)。 小结: 给予多柔比星作用乳鼠心肌细胞,细胞的存活率随多柔比星呈现剂量依赖性下降;荧光染色观察到显著的凋亡特征;Caspase-3活性明显升高;Cleaved PARP-1蛋白的剪切片段表达较正常组显著增加,细胞蛋白硝基化明显增加;给予ONOO-清除剂MnTMPyP后,与多柔比星组相比,凋亡得到了明显改善,蛋白硝基化程度降低。 第二部分硫氧还蛋白硝基化在多柔比星诱导乳鼠心肌细胞凋亡中的作用 目的: 通过直接给予多柔比星刺激和预孵育ONOO-清除剂MnTMPyP后给予多柔比星诱导细胞凋亡,观察此过程中Trx的硝基化情况,Trx-ASK1的表达、ASK1的活化情况以及对ASK1介导的P38凋亡信号通路的影响。 方法: 1.体外培养的乳鼠心肌细胞,生长发育成熟后,给予不同浓度的多柔比星作用24h,免疫沉淀富集蛋白,免疫印迹检测Trx-Nty(NitroTyrosine,硝基酪氨酸)的表达。实验分组为: 1、正常组(Control):正常培养24h; 2、0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L和10μmol/L多柔比星组:分别给予正常培养的细胞上述浓度多柔比星培养。 2.培养乳鼠心肌细胞,待细胞发育成熟后,预孵育MnTMPyP2h,给予1μmol/L多柔比星作用24h,免疫沉淀法和免疫印迹法检测Trx-Nty和Trx-ASK1的表达情况。实验分组为: 1、正常组(Control):正常培养24h; 2、1μmol/L多柔比星组:正常细胞给予1μmol/L多柔比星培养24h; 3、1μmol/L多柔比星+30μmol/LMnTMPyP组:预孵育30μmol/LMnTMPyP2h,给予1μmol/L多柔比星作用24h; 4、给予30μmol/L MnTMPyP 24h。 3.给予发育成熟的乳鼠心肌细胞30μmol/L MnTMPyP 2h,给予1μmol/L多柔比星作用,24h后western blot法检此过程中p-ASK1(ser967)的表达。实验分组: 1、正常组(Control):正常条件下培养24h; 2、1μmol/L多柔比星组:正常条件下给予1μmol/L多柔比星培养24h; 3、1μmol/L多柔比星+30μmol/L MnTMPyP组:预孵育30μmol/L MnTMPyP 2h,给予1μmol/L多柔比星作用细胞24h; 4、正常条件下给予30μmol/L MnTMPyP 24h。 4.给予发育成熟的乳鼠心肌细胞30μmol/L MnTMPyP 2h,给予1μmol/L多柔比星作用,30min后,western blot法检测p-p38、p38的表达。实验分组: 1、正常组(Con):正常条件下培养30min; 2、1μmol/L多柔比星组:正常条件下给予1μmol/L多柔比星培养30min; 3、1μmol/L多柔比星+30μmol/L MnTMPyP组:预孵育30μmol/L MnTMPyP 2h,给予1μmol/L多柔比星作用细胞30min; 4、正常条件下给予30μmol/L MnTMPyP 30min。 结果: 1.乳鼠心肌细胞给予不同浓度的多柔比星作用24h后,免疫沉淀和免疫印迹检测,1μmol/L、3μmol/L与10μmol/L多柔比星组Trx硝基化程度升高,与对照组MTT值比较均有显著差异(P<0.05)。 2.给予1μmol/L多柔比星作用心肌细胞24h后,Trx硝基化程度明显增加,(P<0.05);与1μmol/L多柔比星组相比,1μmol/L多柔比星+30μmol/L MnTMPyP组较多柔比星组Trx硝基化程度明显降低(P<0.05)。 3.给予1μmol/L多柔比星作用心肌细胞24h后,与正常组比较细胞内Trx-ASK1表达降低(P<0.05);与1μmol/L多柔比星组相比,1μmol/L多柔比星+30μmol/L MnTMPyP组Trx-ASK1明显增高(P<0.05)。 4.给予1μmol/L多柔比星作用心肌细胞后,与正常组比较细胞内p-ASK1(ser967)的表达明显减少(P<0.05);与多柔比星组相比,1μmol/L多柔比星+30μmol/L MnTMPyP组p-ASK1(ser967)表达增加(P<0.05)。 5.给予1μmol/L多柔比星作用心肌细胞30min后,与正常组比较细胞内p-p38表达显著增加(P<0.05),与多柔比星组相比,多柔比星+30μmol/L MnTMPyP组p-p38显著增加(P<0.05);各组之间p38的表达无显著差异。 小结: 多柔比星诱导心肌细胞凋亡过程中Trx-NitroTyrosine表达升高,Trx硝基化程度增加;Trx-ASK1表达降低,ASK1活化形式增加,促凋亡蛋白激酶p38的激活;ONOO-清除剂MnTMPyP可以减少Trx与ASK1分离,抑制ASK1、P38活化;这可能与Trx发生硝基化有关。 结论: 1.给予不同浓度多柔比星刺激心肌细胞后,细胞内蛋白硝基化程度明显增加,与多柔比星作用浓度呈现一定的剂量依赖性;Caspase-3,PARP-1等蛋白发生显著活化是细胞发生凋亡原因之一。 2.预孵育ONOO-清除剂MnTMPyP后,蛋白硝基化程度降低;Caspase-3,PARP-1等蛋白活化减少,细胞凋亡减轻。蛋白硝基化可能是多柔比星诱发凋亡的标志和(或)影响因素之一。 3.多柔比星诱导心肌细胞凋亡过程中Trx硝基化程度增加,Trx-ASK1表达减少,ASK1活化形式增加,ASK1介导的凋亡信号通路激活。多柔比星诱导心肌细胞凋亡可能与Trx的硝基化有关。